肺泡灌洗液中性粒細胞比例聯合革蘭染色對肺炎的診斷效能研究

盛夢秋 張玉 張淇瑋 張鑫強 侯鐵英，

1廣東省人民醫學院（廣東省醫學科學院），廣東省心血管病研究所，廣東省臨床檢驗中心（廣州510120）；廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）2檢驗科，3醫務處（廣州 510120）

肺炎是指終末氣道、肺泡和肺間質的炎癥，根據獲得環境，可分為社區獲得性肺炎（communityacquired pneumonia，CAP）和醫院獲得性肺炎（hospital-acquired pneumonia，HAP）［1］。HAP 是我國最常見的醫院獲得性感染，診斷治療較為困難，病死率高［2-3］。據世界衛生組織報道，2010-2019年下呼吸道感染已成為感染性疾病中死亡人數最多的疾病，盡管死亡總人數有減少［4］。肺炎常用的微生物學檢驗方法為涂片革蘭染色鏡檢和病原微生物培養［5］。臨床上肺炎送檢標本多為痰標本，但痰標本的采集多出現被口腔內細菌污染的情況，革蘭染色鏡檢無法區分病原體是定植或感染，培養所需時間較長，且二者陽性率均不高。支氣管肺泡灌洗液（broncho alveolar lavage fluid，BALF）污染率較低，并且病原菌檢出率高于痰液、血液［6-7］。WALTER 等［8］發現BALF 中性粒細胞比例下降50%對危重細菌性肺炎的患者陰性預測效能高達90%。也有研究發現，呼吸道樣本革蘭染色（gram staining）有助于呼吸機相關性肺炎（ventilator-associated pneumonia，VAP）的早期診斷，指導抗生素使用［9-10］。但目前BALF 中性粒細胞比例對肺炎診斷尚無明確標準。本研究回顧性分析肺炎患者肺泡灌洗液中性粒細胞比例，聯合革蘭染色對肺炎進行診斷，并對其診斷效能進行評估。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究納入2018年9月至2021年5月期間在廣東省人民醫院氣管鏡室送檢呼吸內科BALF 標本的住院患者。共188 例患者納入研究，肺炎患者108 例為實驗組，非肺炎患者80 例為對照組，肺炎患者中CAP 74 例，HAP 34 例。通過醫院信息系統（hospital information system，HIS）、實驗室信息管理系統（laboratory information management system，LIS）對患者的人口學特征、臨床資料和實驗室檢查結果進行查詢，收集患者人口學特征、出入院診斷、抗生素使用、住院天數、臨床診斷、疾病轉歸、患者BALF 中性粒細胞比例、BALF革蘭染色等臨床信息和實驗室檢查結果。本研究經廣東省人民醫院倫理委員會審批通過。

1.2 分組和方法 入選標準：（1）年齡≥18 歲；（2）行支氣管鏡留取BALF 標本送檢的住院患者，（3）臨床診斷與實驗室結果一致。排除標準：（1）BALF 不合格標本≤5 mL；（2）患者病例資料不全。依據CAP 和HAP 診斷和治療指南［4，11］，結合臨床診斷，將患者分為肺炎組和非肺炎組。肺炎組包括CAP 和HAP 患者，非肺炎包括非病原菌感染的肺部疾病，如肺癌、肺結節、慢性阻塞性肺病等行支氣管肺泡灌洗的患者。BALF 的實驗室預處理遵循中華醫學會呼吸病學分會專家共識［12］。

1.3 診斷標準 依據2016年中華醫學會呼吸病學分會修訂的《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南》。CAP 臨床診斷標準：（1）社區發??；（2）肺炎相關臨床表現：新近出現的咳嗽咳痰或原有呼吸道疾病加重，伴或不伴膿痰、胸痛、呼吸困難及咯血；肺實變體征和（或）聞及濕啰音；發熱；外周血白細胞＞109/L 或＜4 × 109/L，伴或不伴細胞核左移；（3）胸部影像學檢查顯示新出現的斑片狀浸潤影、葉或段實變影、磨玻璃影或間質性改變，伴或不伴胸腔積液。符合（1）（3）及（2）中任何一項，并除外其他肺部疾病后，可建立臨床診斷［4］。

依據2018年中華醫學會呼吸病學分會感染學組制定的《中國成人醫院獲得性肺炎與呼吸機相關性肺炎診斷和治療指南》。HAP 是指患者住院期間沒有接受有創機械通氣、未處于病原感染的潛伏期，而于入院48 h 后新發生的肺炎［11］。

1.4 統計學方法 運用SPSS statistics 21.0 軟件對數據進行統計學分析，計量資料采用（）表示。采用偏度-峰度檢驗法來檢驗各組數據的正態性，并采用分位數圖（Q-Q plot）來驗證。若該資料服從正態分布，則使用獨立樣本的t檢驗，非正態分布采用曼-惠特尼U檢驗（Mann-WhitneyUtest）。計數資料用χ2檢驗或者Fisher 確切概率法。制作ROC曲線，通過曲線下面積（area under curve，AUC）對指標診斷效能進行分析，采用logistic 回歸分析制作BALF 中性粒細胞計數聯合鏡下染色鑒別診斷肺炎和非肺炎的ROC 曲線，靈敏度和特異度。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 患者基本情況 本次共收集肺炎患者108 例，非肺炎患者80 例。肺炎患者中CAP 74 例，HAP 34例；80 例革蘭染色鏡下可見病原菌。兩組患者的年齡、性別等資料進行比較，肺炎患者中男性比例較高（P＜0.001），BALF 中性粒細胞比例肺炎組明顯高于非肺炎組（P＜0.01），革蘭染色結果差異有統計學意義（P＜0.001），其余差異無統計學意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 患者臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of patients ±s

表1 患者臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of patients ±s

注：a 鏡下可見病原菌

年齡（歲）男性［例（%）］住院天數（d）使用抗生素［例（%）］BALF中性粒細胞比例（%）革蘭染色a（%）好轉［例（%）］肺炎（n=108例）64±15 83（76.9）13±10 92（85.2）73.75±42.05 80 87（80.6）非肺炎（n=80例）63±17 36（45.0）10±6 52（65.0）28.85±46.25 0 60（75.0）P值0.296 0.001 0.423 0.072＜0.01 0.001 0.074

2.2 BALF 中性粒細胞在CAP 患者及HAP 患者中的分布 本實驗CAP 患者74 例，HAP 患者34 例。CAP 組和HAP 組的數據不服從正態分布，二者方差不齊，因此采用Mann-WhitneyU檢驗對兩組樣本進行比較，得P＞0.05，CAP 和HAP 患者中BALF中性粒細胞比例差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 CAP 患者及HAP 患者中BALF 中性粒細胞比例的分析結果Tab.2 The results of neutrophil ratio in BALF of patients with CAP and HAP ±s

表2 CAP 患者及HAP 患者中BALF 中性粒細胞比例的分析結果Tab.2 The results of neutrophil ratio in BALF of patients with CAP and HAP ±s

項目中性粒細胞（%）CAP（n=74例）71.55±41.78 HAP（n=34例）75.25±50.88 Z值-0.443 P值＞0.05

2.3 ROC 曲線分析

2.3.1 BALF 中性粒細胞比例鑒別診斷肺炎的ROC 曲線及分析 在鑒別診斷肺炎與非肺炎中，BALF 中性粒細胞比例AUC 分別是0.728，Cut-off值為41.45，靈敏度為0.750，特異度為0.675。見圖1。

圖1 BALF 中性粒細胞診斷肺炎ROC 曲線Fig.1 The ROC curve of BALF neutrophils ratio in diagnosis of pneumonia

2.3.2 BALF 中性粒細胞比例聯合革蘭染色鑒別診斷肺炎的ROC 曲線及分析 對兩組數據進行logistic 回歸分析，使用二元logistic 回歸分析，得到logistic 回歸方程的常數項以及各項系數，可得回歸方程logit（P）=1.128+0.064 革蘭染色-0.031 中性粒，可得聯合預測因子=革蘭染色-中性粒*0.031/0.064。構建聯合因子鑒別診斷肺炎與非肺炎的ROC 曲線，如圖2，AUC 為0.731，Cut-off 值為22.09，靈敏度分別是0.724，特異度為0.703。

圖2 BALF 中性粒細胞比例聯合革蘭染色診斷肺炎的ROC 曲線Fig.2 The ROC curve of BALF neutrophil ratio combined with gram stain in diagnosis of pneumonia

2.3.3 BALF 中性粒細胞不同比例對肺炎的診斷靈敏度、特異度特征 評價肺炎患者中不同中性粒細胞比例靈敏度、特異度特點，中性粒細胞比例≥20%，特異度為25%，陰性預測值較高為75%；中性粒細胞比例≥80%的時候靈敏度最高為97.4%，特異度最低為11.3%，陽性預測值較高為80.5%。如表3。

表3 BALF 中性粒細胞比例對肺炎的診斷靈敏度、特異度特征Tab.3 Sensitivity and specificity of BALF neutrophil ratio in diagnosis of pneumonia

3 討論

肺炎已成為全球感染性疾病死亡的主要原因之一［2］。我國目前尚無成人CAP 發病率數據，僅有年齡構成比的研究［3］，CAP 和HAP 的發病率和死亡率均隨著年齡的增加而升高［4，8］。我國一項大規模醫院感染橫斷面研究［11］結果表明，住院患者醫院獲得性感染的發生率為3.22% ～5.22%，其中醫院獲得性下呼吸道感染率為1.76% ～1.94%。ANGUS 等發現，肺炎是重癥監護室（intensive care unit，ICU）和非重癥監護室（non-intensive care unit，non-ICU）患者主要的住院死亡原因［13］。我國不同地區HAP 和CAP 的致病菌分布和耐藥性有很大的區別，不同程度病原菌耐藥給CAP 和HAP 的治療帶來困難［11］，肺炎診斷的不確定和病因不明易導致未感染患者抗生素的過度使用，增加抗生素的耐藥性。因此，找到快速、有效的肺炎早期診斷指標，減少抗生素的過度使用是非常有必要的。

目前常見肺部病原微生物檢測方法有涂片染色鏡檢、培養基培養、血清檢測、核酸檢測和宏基因組二代測序計數（metagenomics next generation sequencing，mNGS）等，涂片鏡檢存在一定的漏檢率，培養、核酸檢測和mNGS 的報告時間至少需要24 h［14］，都不是快速有效的肺炎診斷治療相關指標，尤其是在重癥患者中，無法快速指導治療方案。有研究者提示細胞學檢查在感染性疾病診斷中的重要性［15］在肺部急性炎癥反應中，中性粒細胞（neutrophils）是最先進入肺損傷部位的反應細胞［16］，對鑒別感染有較好的臨床效能［17］，且BALF中3%感染細胞對肺炎有較高的預測價值［18］。有學者建議肺泡灌洗液檢查與細胞特殊染色相結合，可以快速識別微生物病原體引起的肺炎，及時指導抗生素治療，降低死亡率［19］。

有研究表明，BALF 中性粒細胞比例與肺結節病、彌漫性肺泡損傷、特發性肺纖維化、硬皮病等疾病有關，這些非病原體感染肺部炎癥反應疾病均會導致BALF 中性粒細胞比例升高［20-21］，由表1可見兩組患者抗生素使用率較高，抗生素的經驗性使用對BALF 中性粒細胞比例也有一定的影響，因此BALF 中性粒細胞比例升高并不能作為診斷肺炎的唯一標準。由表3 可知，肺炎患者中BALF中性粒細胞比例越高，診斷肺炎的靈敏度越高，陽性預測值也越高，對肺炎的早期診斷、早期治療、改善預后有更大的意義。

本研究回顧性納入了188 例呼吸內科住院患者，其中肺炎診斷108 例，非肺炎診斷80 例，肺炎患者中CAP 74 例，HAP 34 例，分析發現肺炎組患者BALF 中性粒細胞計數明顯高于非肺炎患者（P＜0.01），但在CAP 和HAP 患者中差異無統計學意義（P＞0.05）。通過ROC 曲線分析，BALF 中性粒細胞比例鑒別診斷肺炎和非肺炎的AUC 為0.728，Cut-off 值為41.45，靈 敏度0.750 和特異度0.675，有一定的診斷效能。BALF 中性粒細胞比例聯合鏡下革蘭染色鑒別診斷肺炎和非肺炎患者的AUC 為0.731。聯合診斷效能稍高于單一BALF 中性粒細胞比例的診斷效能，BALF 中性粒細胞比例Cut-off 值為22.09，表明在得知革蘭染色結果的情況下，BALF 中性粒細胞比例高于22.09%，提示肺炎的可能性大，且其特異度明顯高于單一使用BALF 中興粒細胞比例鑒別診斷肺炎和非肺炎患者，對肺炎的診斷更具有準確性。

本研究同時也具有一定的局限性，SONG 等［22］發現流式細胞儀可提高BALF 中細胞檢測的敏感性，我院BALF 中性粒細胞計數是依靠人工鏡檢來檢測，具有一定的誤差性，對結果有一定的影響。BALF 在采樣過程中灌洗的部位和灌洗液回收量、標本的預處理都有可能影響到BALF 細胞分類計數［12，23］。在對肺炎患者的分析中并未對感染病原菌進行分類分析，可進一步對BALF 中性粒細胞比例在細菌和真菌性肺炎中的診斷效能進行研究。并且，本研究為單中心回顧性研究，多中心前瞻性研究是有必要的。

綜上所述，BALF 中性粒細胞比例對肺炎具有較高的診斷效能，對重癥患者早期治療有提示意義。BALF 中性粒細胞比例聯合革蘭染色對肺炎患者有一定的早期診斷效能，對患者個體化治療和抗生素方案有一定指導作用，但需結合患者的臨床癥狀和影像結果等進行多方位評估。