拉曼光譜技術在腎臟病變鑒別診斷的應用進展

安蔚 梁昊岳 孔曉冬

1天津醫科大學總醫院保健醫療部（老年醫學科），天津市老年病學研究所（天津 300052）；2中國醫學科學院血液病醫院（中國醫學科學院血液學研究所），實驗血液學國家重點實驗室，國家血液系統疾病臨床醫學研究中心，細胞生態海河實驗室（天津 300020）

近年來腎臟疾病比例逐年升高［1］，已成為全球性重要公共衛生問題之一，一項30年（1990-2019）的調查研究顯示，在全球范圍內，亞洲的慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）患病率最高，2019年新增CKD 病例980 萬例，其中763 024 例死于CKD 及其并發癥，1990-2019年間，CKD 患病率增長一倍，從2.024 億增至4.312 億，造成巨大經濟負擔［2］。早期發現及有效防治腎臟疾病對于改善患病人群后期生存質量具有重大意義。如何早期發現并及時干預保護老年人腎功能仍然是目前臨床中急需解決的問題。腎臟生理結構復雜、腎臟疾病發病機制及病因多樣性、早期腎臟疾病臨床癥狀特異性差等因素導致腎臟疾病早期診斷仍然存在困難。目前腎臟疾病診斷的輔助檢查主要包括血液化驗、尿液化驗、影像學檢查以及“金標準”腎臟活檢，外泌體蛋白質組學分析［3］、MRI 等對于診斷腎臟疾病的價值也在不斷上升［4］。但是上述輔助檢查存在價格昂貴、操作繁瑣、敏感性及特異性不足等缺點，仍需探索新的診斷手段以期早期診斷腎臟疾病。

近年來，拉曼光譜技術（Raman spectroscopy，RS）在檢測新的生物標記物方面頗具潛力，可協助臨床篩查疾病的易感性和發病率。與傳統檢測方法相比，其具有非侵入性、所需樣本量小、化學試劑消耗量少等優點。拉曼光譜技術目前已實現無創檢測血液、尿液、腦脊液、唾液等生物標本，可用于活體內的微創、實時組織監測，輔助臨床診斷神經退行性疾病（如阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側索硬化癥等）［5-6］、傳染性疾?。ㄈ绡懠?、非洲錐蟲病、新冠病毒等）［7-8］、腫瘤性疾病（如腦癌、卵巢癌、膀胱癌、皮膚癌、胃腸道癌、肺癌等）［9-10］的診斷。既往有研究將RS 技術與算法模型相結合，測定腎病患者血清中尿素和肌酐的濃度、尿液中的尿素、肌酐、尿蛋白及葡萄糖含量，表明RS 技術可無創監測某些特定的腎功能指標，從而達到早期篩查腎臟疾病的目的［11］。SAATKAMP 等［12］應用RS 技術結合PLS（部分最小二乘法）模型檢測尿液中尿素和肌酐的濃度，發現無腎臟疾病患者尿液樣本的拉曼光譜，峰值分別為527、1 006、1 160 /cm 處（指示尿素的存在）以及681、846、908 /cm 處（指示肌酐的存在），使用該模型估計糖尿病和高血壓患者的尿素和肌酐濃度發現，此類人群檢測指標較健康受試者明顯較低。上述研究表明RS 技術對于腎臟疾病鑒別診斷具有一定實用性及巨大潛力。因此，關于RS 技術在腎臟疾病鑒別診斷方面的探索，是本文重點闡述的內容，本文主要從急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）、慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease，CKD）、繼發性腎病、其他類型腎病等幾方面重點論述RS 技術原理、技術優勢、局限性、最新應用前景等。

1 RS 技術與AKI

1928年，C.V RAMAN 首次報道了一種分子對光的非彈性散射現象，并以他的名字將這種現象命名為“拉曼效應”，這種散射輻射稱為“拉曼散射”。拉曼光譜技術，即測量拉曼散射輻射，通過使用單色光源（通常為激光）來檢測從樣品非彈性散射的光子，從而提供關于化學鍵和分子結構的信息，并且每個分子都會產生一個獨特的“光譜指紋”［13］，生物分子的拉曼光譜包含豐富且復雜的信息，一般情況下需使用多元統計方法降低此類復雜數據集的維數來突出這些光譜差異，并能夠提取重要生物信息，從而實現主成分分析以協助診斷和分類。利用RS 技術原理對生物標本進行分析，提取生物信息，近年來在腎臟疾病鑒別診斷領域成為熱點。

KDIGO 指南對AKI 的定義［14］是出現以下情況的任意一種：48 h內血清肌酐（serum creatinine，SCr）升高≥26.5 μmol/L；或已知或認定在過去7 d 內SCr升高≥基線值的1.5 倍；或6 h 尿量＜0.5 mL/（kg·h）。臨床中AKI 患者發生CKD、終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD）風險性增加，因此早期診治顯得尤為重要。目前AKI 診斷標準基于SCr 和（或）尿量的改變，但由于腎損傷發生在肌酐升高之前，因此血清肌酐對于預測AKI 仍有一定限制，仍需要更加準確的生物標志物來預測AKI。既往的研究表明，術前胱抑素C［15］、術前白蛋白/肌酐比值［16］可預測圍手術期AKI 的發生；尿中性粒細胞明膠酶相關脂質沉積蛋白（NGAL）、血漿NGAL 和尿白細胞介素-18（IL-18）與成人心臟手術患者AKI 的發生和不良預后相關［17］；尿中IL-18、胱抑素C、腎損傷分子1（KIM 1）和肝型脂肪酸結合蛋白的濃度也可預測內源性AKI［18］。

最新的傅里葉變換RS 技術研究發現［19］，腎缺血再灌注后伴隨的生理穩態變化，可以顯示出特征性的振動光譜變化。酪氨酸、色氨酸、胱氨酸/半胱氨酸、成纖維細胞生長因子、膠原蛋白Ⅲ是與振動變化相關的代謝產物，這些譜帶可能成為與腎損傷患者心臟病發展相關的分子標記物，在檢測與急性至慢性腎損傷進展相關的分子標記和死亡預測因子方面具有一定臨床意義。相比于常規檢測技術，拉曼光譜技術具有無創、標本較易獲取、可實時反映機體情況等優勢，對于疾病早期篩查階段具有重大臨床意義。但目前對于急性腎損傷方面的拉曼光譜臨床研究仍不夠完善，同時仍未確定明確的生物標志物來特定反應急性腎臟損傷，未來應繼續提高拉曼光譜技術對于急性腎損傷標志物識別的敏感性及特異性，發現更多指向急性腎損傷的拉曼光譜峰位，從而更好的輔助臨床診斷、篩查，更早發現腎臟損傷。

2 RS 技術與CKD

慢性腎臟疾病是世界范圍內主要的非傳染性疾病之一，在不同的國家，它影響著5%～13%的總人口［20］。CKD 是指腎臟損害或腎小球濾過率（GFR）下降持續3 個月及以上，并根據病因、GFR和蛋白尿標準（CGA 分類）進行分類，其中GFR 可以通過尿液和血液中過濾標記物的血漿清除率來評估，CKD 的診斷主要基于血清肌酐的測量和相應的估算的腎小球濾過率（estimated GFR，eGFR）的計算。既往的研究證明，老年人群查體時增加尿白蛋白、尿肌酐、血尿酸的定量檢測，有助于腎臟損傷早期階段CKD 的篩查［21］。CKD 可能生物標志物包括eGFR、NGAL、胱抑素C、不對稱二甲基精氨酸（ADMA）、肝型脂肪酸結合蛋白（L-FABP）、血尿素氮（BUN）、白蛋白排泄率（AER）等，近年來有研究表明可溶性尿激酶型纖溶酶原激活劑受體（suPAR）、腫瘤壞死因子受體（TNF-R）、表皮生長因子（EGF）、半乳糖凝集素3（Galectin-3）等可用作CKD 早期診斷的生物標志物［22］，但由于CKD 通常起病隱匿，早期診斷仍然存在挑戰，因此需要更敏感、更簡便的檢測方法。

近期的研究［23］表明，RS 技術對于SCr、BUN、血清胱抑素C 的陽性檢出率均明顯高于常規腎功能檢查，說明RS技術可用于CKD的診斷。KAMINSKA等［24］首次證實尿液細胞外囊泡（UEV）的RS 特征可作為區分健康受試者和患有不同階段CKD 的糖尿病患者的生物標記物；ZONG 等［20］研究發現，檢測CKD 組和健康對照組的血清標本時，約1 094、1 290、1 398 /cm 處的SERS 峰僅出現在CKD 患者中，而在健康對照組中未發現特別顯著的峰，同時還發現CKD 患者在724、1 328、1 450 /cm 處的SERS 峰值強度高于健康對照組，而對照組在641、811、890、1 132、1 210、1 655 /cm 處的SERS 峰值強度高于CKD 患者；檢測尿液標本時，健康對照組在640、724、1 137、1 343/cm 處的SERS 峰強度高于CKD 患者，而在1 079、1 185、1 287、1 383 /cm 處的SERS 峰強度增加在CKD 患者中更加明顯。這些尿液光譜的標記峰位代表了其主要成分（例如尿素、肌酐、肌酸、酮體、磷酸鹽、含氮化合物等），他們的研究表明血清和尿液樣本的SERS 分析與PCA-LDA（主成分分析-線性判別分析）方法相結合，對于快速評估CKD 分期具有良好的潛力。熊聲賀等［23］通過研究慢性腎病人群與健康人群拉曼光譜血清對比，CKD 組在544、724、933、1 004、1 368、1 442、1 607 /cm 處平均特征峰值強度均明顯低于健康對照組，而在1 127、1 219 /cm 處特征峰值強度均明顯高于健康對照組。

慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）是CKD持續進展后的結局，是終末期腎臟損害的一個階段，表現為代謝產物潴留和水、電解質及酸堿失衡以及各系統癥狀，最終可發展為尿毒癥。CHEN 等［25］的研究表明，健康對照組和CRF 患者組的拉曼光譜都存在酰胺Ⅲ（1 230～1 282/cm）、磷脂（1 447/cm）和蛋白質（1 585/cm），但在CRF 患者光譜中發現磷脂（1 447/cm）和蛋白質（1 585、1 615、1 654/cm）的拉曼峰相對強度高于正常腎功能的對照組。WANG等［26］還發現血清拉曼光譜結合分類算法可以快速準確地診斷和區分甲狀腺異?；颊?、慢性腎功能衰竭患者和健康個體：慢性腎功能衰竭患者的類胡蘿卜素水平（1 006、1 157、1 515 /cm）高于甲狀腺功能異?；颊吆徒】祩€體。此外，GAO 等［27］將血清拉曼光譜和卷積神經網絡（CNN）相結合，發現CRF 患者和正常人的血液拉曼光譜在1 003/cm等處均有高強度峰值，但正常人的峰值強度明顯高于CRF患者；CRF患者光譜在957、1 193、1 210/cm處的峰值強度均不同程度低于正常人，而在1 445、1 655/cm處的峰值強度略高于正常人。BRATCHENKO 等［28］通過拉曼光譜技術結合PLS-DA（偏最小二乘法）模型，表明利用拉曼光譜進行皮膚分析可能用于識別腎衰竭。上述研究成果說明血清拉曼光譜技術可能成為臨床輔助診斷CRF 工具，從而早期發現CRF。

上述研究結果表明，CKD、CRF 患者與健康人之間的血液、尿液等生物標本通過RS 技術分析后可呈現特定差異，為早期發現腎臟病變提供了新的技術手段，與臨床上常用的傳統輔助化驗檢查及有創操作相比，其表現出更高的準確性、所需樣本量少、重復操作性高等優勢，不足之處在于關于慢性腎臟病的相關研究數據尚不完善，尚未建立系統的RS 技術篩查體系，未來應繼續完善RS 技術在相關方面的研究，利用RS 技術優勢，實現更加快速、高效地評估患者腎功能，發展為非侵入性輔助診斷、快速篩查的技術手段。

3 RS技術與繼發性腎?。╯econdary nephrosis）

繼發性腎病指腎外疾病，特別是全身性、系統性疾病導致的腎損害。雖然全身性疾病引發的腎損害有一定的交叉，但仍然可以根據全身性疾病進行分類。全身性疾病見于糖尿病、高血壓、自身免疫性疾病、淀粉樣變、腫瘤、感染及某些遺傳性疾病等。在我國，糖尿病腎病及高血壓腎病是終末期腎病的主要病因［29］。

3.1 糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）DN 是終末期腎病最常見的病因［30］，其基本病理特征是腎小管間質病變、腎小球基底膜增厚、系膜基質積聚和結節性腎小球硬化［31］，主要臨床表現為不同程度蛋白尿及腎功能的進行性減退，DN 的診斷標準包括腎功能下降、糖尿病視網膜病變、尿白蛋白與肌酐比值升高以及腎小球濾過率降低［32］。隨著糖尿病發病率的上升，DN 已成為中國CKD 的第一大病因［33］，其中大多數DN 由2 型糖尿病發展而來。但DN 的預防和治療仍然面臨著挑戰，其中一個困難就是疾病初期，在蛋白尿出現之前已發生早期腎損害［34］，而無任何臨床表現。如何在無癥狀階段發現早期糖尿病腎臟損害，是臨床中需要解決的問題。FLORES-GUERRERO 等［35］通過拉曼光譜檢測2 型糖尿病患者尿液標本，發現尿液中的肌酐、尿素、水和白蛋白等物質在拉曼光譜中有其對應的拉曼峰，其中1 450 /cm 處的拉曼信號強度增加，對應于尿白蛋白濃度的升高，此方法可發現糖尿病患者低濃度的尿蛋白排泄增多，可應用于篩查早期糖尿病腎病；HUANG 等［11］首次將SERS 與PDA 芯片相結合，用于檢測尿液中的微量白蛋白，以上研究表明拉曼光譜技術應用于篩查糖尿病腎病的可行性。

3.2 高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）相關腎病 高尿酸血癥相關腎病在臨床上分為急性和慢性高尿酸性腎病及尿酸性腎結石。急性尿酸性腎病一般都有明確的誘因，可表現為少尿性腎功能衰竭。尿酸是嘌呤在肝臟內進行一系列代謝后的終產物，一般是由細胞代謝分解的核酸、嘌呤類化合物及食物中的嘌呤產生，最后經腎臟排出體外。慢性腎臟病中合并無癥狀HUA 的發生率逐年升高［36］，高尿酸血癥可繼發于腎臟疾病，并可進一步加重腎臟疾病的發展，可導致高尿酸腎損害（包括急性和慢性高尿酸血癥性腎病及尿酸性腎結石）［37］，因此早期發現高尿酸血癥可減輕高尿酸腎損害。高尿酸血癥是指人體內嘌呤代謝異常而引起血尿酸升高的一種代謝綜合征。根據《中國高尿酸血癥及痛風診療指南（2019）》［38］，高尿酸血癥診斷標準為：無論男女性別，非同日2 次測量血尿酸水平超過420 μmol/L。目前臨床上常用的尿酸檢測方法為磷鎢酸還原法和尿酸酶—過氧化物酶偶聯法等，但是上述方法存在操作繁瑣等諸多不足，因此需要更加簡便的方法測定尿酸水平。有研究表明［39］，通過利用高效液相色譜法、吸光度下降法、毛細管電泳法及流動注射化學發光法等嘗試檢測尿液中尿酸含量后，發現上述方法具有前處理步驟復雜、儀器設備要求高、成本高等缺點，因而不適用于臨床。還發現將150 nm 的金納米粒子作為基底，利用表面增強拉曼光譜技術在0.01～0.5 mmol/L 范圍內對尿液中的尿酸含量進行定量分析，可以高效、便捷地測定尿液中尿酸。此外，已有大量研究應用拉曼光譜技術監測尿酸水平，并取得了一定進展。HERNANDEZ 等［40］通過將電化學表面氧化增強拉曼散射（EC-SOERS）與平行因子分析（PARAFAC）模型的相結合，實現了在相關復雜樣品中測定尿酸；WANG 等［41］研究發現采用銀碳點納米復合材料作為SERS 基底時，在1 605/cm 處可以檢測到oxTMB（氧化3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺，UA 還原后的產物）的SERS 信號，從而實現檢測尿酸的目的；ALULA 等［42］首次采用ZnO/Fe3O4制備SERS 襯底，這種材料穩定且靈敏，可應用于測定尿液中的尿酸，且無需對尿標本進行預處理，從而簡化了尿酸測定過程。上述研究證實拉曼光譜技術可用于尿酸的快速檢測，為快速、簡便檢測尿酸提供了可能。

3.3 ANCA 相關性腎小球腎炎（ANCA-associated glomerulonephritis，AAGN） 抗中性粒細胞胞漿自身抗體（antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）相關血管炎是一種自身免疫疾病，可累及全身多個臟器，當累及腎臟時可出現蛋白尿、血尿、高血壓等臨床癥狀，腎活檢是診斷血管炎腎病的“金標準”，但由于病程的反復性，需要更為簡便、安全的輔助檢查手段進行復查或早期篩查。MORRIS等［43］利用拉曼光譜技術對AAGN 患者尿液標本進行光譜數據分析，發現光譜數據能夠高度準確地區分慢性損傷和活動性疾病的組織學病變，從而確定疾病是否處于活動期，為AAGN 的診斷與篩查提供了新的方向。

綜上，拉曼光譜技術在幾種常見的繼發性腎病方面已有一定探索，并表現出無創、簡便等優勢，同時可以減少實驗室一次性耗材的使用，是更可持續發展的技術手段。不足之處在于，目前RS 技術尚不能同時檢測尿液中的多種蛋白質，而且由于設備昂貴等問題，難以大規模投入臨床。同時，目前未檢索到關于RS 技術在高血壓腎病方面的探索，未來應繼續探索RS 檢測技術在血管相關性腎病方面的研究，如腎動脈狹窄相關腎病等，完善檢測尿液中的多種蛋白質的方法，進一步降低技術操作成本，使RS 技術在臨床推廣成為可能。

4 RS 技術與其他類型腎病

腎臟疾病包含種類眾多，除上述已經提到的研究進展外，拉曼光譜技術在其他腎臟疾病方面也有所發展。研究表明，RS 技術結合多變量分析可用于診斷急性腎炎小鼠［44］；MULLER-DEILE 等［45］發現，RS 能夠在血清和組織水平上分析出復發性特發性局灶節段性腎小球硬化（FSGS）的“分子指紋”，并揭示與患者血清質譜相對應的代謝組學變化，他們發現FSGS 組與健康對照組的拉曼峰在對應于膜結合磷脂酰膽堿、苯丙氨酸、磷脂、脂肪酸和鞘磷脂的波長處存在最顯著差異，RS 不僅可以檢測到血清的血脂異常，還可以檢測到組織水平上的脂質譜變化；HE 等［46］建立了基于光學拉曼光譜的支持向量機（SVM）模型來完成腎細胞癌的診斷，此外一篇Meta 分析表明［47］，RS 對腎癌的總體診斷敏感性為0.96，特異性為0.91。

綜上，既往研究證明RS 技術應用于診斷腎病方面的潛力，與傳統技術手段相比，RS 數據提供了豐富的信息，且能一定程度上定量反映物質濃度，但由于RS 機器操作較為復雜且檢測時間較長，因而對操作人員有較高技術要求，同時光譜數據信息量大，需結合算法分析模型簡化數據，這就使檢驗過程變得較為復雜，未來研究可簡化操作步驟，提高操作易行性，簡化算法模型，從而使拉曼光譜技術更加廣泛應用于臨床。

5 結論與展望

拉曼光譜技術在腎臟疾病鑒別診斷中已取得一定進展，表現出非侵入性、所需樣本量少、重復操作性高等優點，但目前拉曼光譜技術在大多數腎臟疾病診斷方面仍處于探索階段，多局限于實驗室研究階段，相關研究數據尚不完善，尚未建立系統的拉曼光譜技術篩查體系，同時仍存在設備要求嚴格、成本高等問題，應繼續完善拉曼光譜技術在腎臟疾病方面的研究，完善疾病相關光譜峰位等信息，進一步輔助臨床診斷。

本課題組在共聚焦拉曼光譜技術用于血液系統疾病以及神經退行性疾病的鑒別診斷方面已進行了一定探索［48-51］。近期本課題組研究發現，拉曼光譜技術結合OPLS-DA 模型（正交偏最小二乘判別分析），可實現利用骨髓上清液標本檢測不同類型的急性白血病（acute leukemia，AL），并可將AL 患者的生化參數與AL 的分類及預后聯系起來，具有簡便、無創且具有高靈敏度和特異性等優勢［52］。目前本課題組正在研究利用拉曼光譜技術檢測尿液標本，結合尿微量白蛋白肌酐比值等生化指標，以期快速、簡便發現早期腎臟病變。未來將繼續完善RS 技術，增加標本檢測速度，簡化設備，發展居家便攜式儀器以監測特定指標，同時不斷提高其診斷疾病的準確性、敏感性、特異性，降低其應用成本，使之成為更好的輔助檢查工具。不斷發展RS 技術與臨床相結合，發掘拉曼光譜技術在腎臟疾病鑒別診斷的潛能，對于早期診斷腎臟疾病、改善腎臟患者預后，進而減輕后期疾病的經濟負擔具有重大意義。