洋蔥醇提物總黃酮含量的測定及其降脂活性研究

樊孔明，田太成，王曉莉，陳 珍，巫道穎，張建武*，楊春艷*

(1.川北醫學院藥學院 川北醫學院藥物研究所，四川 南充 637100;2.川北醫學院 基礎醫學創新研究平臺，四川 南充 637100;3.川北醫學院 形態研究所，四川 南充 637100)

洋蔥(AlliumcepaL.)為百合科蔥屬多年生草本植物[1]，是膳食黃酮類化合物最豐富的來源之一，為地中海飲食的重要組成部分[2]。洋蔥不僅含有多種維生素、礦物質和氨基酸，還含有多酚、有機硫化合物和皂苷等生物活性成分[3]，具有抗氧化[4-5]、抗菌、抗炎、免疫調節[6]、防癌[7]、降脂、降壓、降血糖、減肥等藥理作用[8]，還可以有效改善非酒精性脂肪肝大鼠的病變[9]。目前，大多數研究僅針對洋蔥粗提物進行動物實驗，而對洋蔥活性成分的研究較少。

黃酮類化合物是以C6-C3-C6為基本結構骨架的多酚類化合物，主要包括黃酮及黃酮醇類、二氫黃酮及二氫黃酮醇類、異黃酮類等。黃酮類化合物多以糖苷形式存在，在自然界中分布極其廣泛，且具有多種生物活性，如抗炎[10]、抗菌、抗病毒、抗腫瘤[11]、預防心血管疾病等，一直是藥物研發的熱點[12-13]。

黃酮類化合物可以和鋁鹽生成黃色絡合物，用于定量和定性分析?；诖耍髡咭匀然X-醋酸-醋酸鈉緩沖溶液為顯色劑，采用紫外分光光度法測定洋蔥醇提物總黃酮含量，通過單因素實驗與響應面法優化洋蔥醇提物總黃酮含量測定的顯色條件，并利用游離脂肪酸(FFA)誘導HepG2細胞建立肝脂肪變性模型評價其體外降脂活性。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

紫皮洋蔥，市售。

蘆丁標準品、脫脂的牛血清白蛋白(d-BSA)、棕櫚酸(PA)、油紅O染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；三水合醋酸鈉、亞硝酸鈉、九水硝酸鋁、六水三氯化鋁，成都科隆化學品有限公司；冰醋酸，西隴科學股份有限公司；DPPH、過硫酸鉀、ABTS，Aladdin；HepG2細胞，川北醫學院分子生物學研究所；DMEM培養基、熱滅活的胎牛血清(FBS)，博士得生物工程有限公司；CCK-8試劑盒，碧云天生物技術有限公司；辛伐他汀，MedChemExpress公司；油酸(OA)，Sigma-Aldrich公司；二辛可寧酸(BCA)蛋白、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)分析試劑盒，南京建城生物工程研究所。

SP-756P型紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司；KQ3200DB型數控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；AC211S型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；超純水機，四川優普科技有限公司；PHS-3C型pH計，上海晶磁儀器有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ型循環水真空泵，河南金傅儀器制造有限公司；AG-9620A型精密鼓風干燥箱，上海柏欣儀器設備廠；MULTISKAN GO型全波長酶標儀、Thermo 3111型CO2細胞培養箱，Thermo Fisher公司；ECLIPSE TS100/TS100-F型倒置顯微鏡，尼康儀器上海有限公司。

1.2 洋蔥醇提物總黃酮含量的測定

1.2.1 標準溶液的制備

精密稱取10.0 mg蘆丁標準品，加適量70%乙醇充分溶解，轉移至25 mL容量瓶中，定容至刻度，即得0.4 mg·mL-1蘆丁標準溶液。

1.2.2 顯色劑的制備

稱取12.131 3 g六水三氯化鋁，用蒸餾水溶解并稀釋至500 mL，即得0.1 mol·L-1AlCl3溶液，再轉移至棕色瓶中保存，備用。稱取6.799 5 g三水合醋酸鈉，用蒸餾水溶解并稀釋至250 mL，即得0.2 mol·L-1醋酸鈉溶液；量取1.15 mL冰醋酸，用蒸餾水稀釋至100 mL，加入到0.2 mol·L-1醋酸鈉溶液中，調節pH值至5.2，即得HAc-NaAc緩沖溶液，再轉移至棕色瓶中保存，備用。稱取亞硝酸鈉0.508 0 g，用蒸餾水溶解并稀釋至10 mL，即得5%亞硝酸鈉溶液。稱取1.760 6 g九水硝酸鋁，用蒸餾水溶解并稀釋至10 mL，即得10%硝酸鋁溶液。稱取1.013 6 g氫氧化鈉，用蒸餾水溶解并稀釋至25 mL，即得4%氫氧化鈉溶液。

1.2.3 供試溶液的制備

稱取新鮮洋蔥5 kg，于45 ℃鼓風干燥箱中干燥后，用粉碎機粉碎。稱取2 175.00 g洋蔥粉末，按料液比1∶10(g∶mL，下同)用70%乙醇回流提取3次，得洋蔥醇提物1 634.50 g，于4 ℃冰箱保存，備用[14]。精確稱取洋蔥醇提物0.281 4 g，用70%乙醇溶解并稀釋至100 mL，常溫(25 ℃)超聲溶解20 min，過濾，即得供試溶液。

1.2.4 最大吸收波長的確定

三氯化鋁-醋酸-醋酸鈉緩沖溶液顯色法：分別移取0.25 mL 0.4 mg·mL-1蘆丁標準溶液和1.0 mL供試溶液置于5 mL容量瓶中，加入0.25 mL 0.1 mol·L-1AlCl3溶液和0.5 mL HAc-NaAc緩沖溶液，用70%乙醇稀釋至刻度；常溫下顯色15 min后，在300～700 nm范圍內進行全波長掃描。

亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法：分別移取0.1 mL 0.4 mg·mL-1蘆丁標準溶液和0.16 mL供試溶液置于5 mL容量瓶中，加入0.15 mL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置6 min；然后加入0.15 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置6 min；再加入2 mL 4%氫氧化鈉溶液，用70%乙醇稀釋至刻度，靜置12 min；常溫下顯色完畢后，在300～700 nm范圍內進行全波長掃描。

1.2.5 顯色條件的優化

1.2.5.1 單因素實驗

準確量取供試溶液1.0 mL于5 mL容量瓶中，加入0.1 mol·L-1AlCl3溶液和HAc-NaAc緩沖溶液，用70%乙醇稀釋至刻度，顯色。采用單因素實驗分別考察顯色溫度(25 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃)、顯色時間(7 min、12 min、17 min、22 min、27 min、32 min)、0.1 mol·L-1AlCl3溶液用量(0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL、1.25 mL)和HAc-NaAc緩沖溶液用量(0.50 mL、0.70 mL、0.90 mL、1.10 mL、1.30 mL)對洋蔥醇提物總黃酮含量測定的影響。

1.2.5.2 響應面法

在單因素實驗的基礎上，選取顯色時間(A)、0.1 mol·L-1AlCl3溶液用量(B)、HAc-NaAc緩沖溶液用量(C)為考察因素，設計3因素3水平響應面實驗，進一步優化洋蔥醇提物總黃酮含量測定的顯色條件。

1.2.6 含量測定

洋蔥醇提物中主要黃酮類成分為異槲皮苷和槲皮素。參照文獻[14]，從洋蔥樣品中提取、分離、純化得到異槲皮苷，采用HPLC法測定洋蔥醇提物中異槲皮苷和槲皮素含量。

1.3 體外降脂活性評價

1.3.1 溶液的制備

精密稱取0.042 3 g洋蔥醇提物(總黃酮提取率75.15%，與洋蔥總多酚對比換算)，加入1 mL DMEM培養基，50 ℃水浴2 h，即得42.3 mg·mL-1洋蔥醇提物溶液，經0.22 μm除菌過濾器除菌，于-20 ℃冰箱保存；稱取0.005 0 g辛伐他汀，加入122 μL無水乙醇和190 μL 0.1 mol·L-1NaOH溶液，50 ℃水浴2 h，用HCl溶液調節pH值至7.2，經0.22 μm無菌濾頭過濾，得16 mg·mL-1辛伐他汀溶液，于-20 ℃冰箱保存。參照文獻[15-16]配制5 mmol·L-1游離脂肪酸(10 mmol·L-1OA∶5 mmol·L-1PA=2∶1，5%d-BSA)，同時配制5%d-BSA，均經0.22 μm無菌濾頭過濾，分裝，于-20 ℃保存。

1.3.2 細胞存活率的測定

使用89%高糖DMEM培養基、10%熱滅活FBS、1%青霉素(100 U·mL-1)及鏈霉素(100 μg·mL-1)配制完全培養基，在5%CO2、37 ℃、飽和濕度的培養箱中培養HepG2細胞；將處于指數生長期的HepG2細胞以每孔3 000～4 000個的密度接種至96孔板中，培養24 h，作為陰性對照組(NC)；然后棄培養液，分組實驗，模型組(FFA)為加入1 mmol·L-1FFA(使用培養液稀釋且d-BSA終濃度為1%，下同)，低濃度洋蔥醇提物組(ACE-L)為加入1 mmol·L-1FFA和總黃酮終濃度為111.17 μg·mL-1的洋蔥醇提物，中濃度洋蔥醇提物組(ACE-M)為加入1 mmol·L-1FFA和總黃酮終濃度為222.34 μg·mL-1的洋蔥醇提物，高濃度洋蔥醇提物組(ACE-H)為加入1 mmol·L-1FFA和總黃酮終濃度為333.52 μg·mL-1的洋蔥醇提物，陽性對照組(PC)為加入1 mmol·L-1FFA和2 μg·mL-1辛伐他汀，每孔溶液總體積均為100 μL；24 h后，棄每孔液體，加入CCK-8溶液(基礎培養基與CCK-8按體積比10∶1配制)110 μL，37 ℃孵育1.5 h后，采用酶標儀在450 nm處進行酶聯免疫吸附測定吸光度(OD)。按下式計算細胞存活率：

1.3.3 降脂活性的評價

將處于指數生長期的HepG2細胞2 mL(約每孔5×105個)接種至6孔板中，待細胞密度達到60%～70%(24 h后)，吸出培養液，PBS緩沖液清洗2次；以1 mmol·L-1FFA作用24 h誘導肝脂肪變性模型[15]，按1.3.2分組進行實驗，加入溶液總體積為2 mL；建模的同時加藥處理，24 h后根據試劑盒說明分別進行油紅O染色，測定細胞內甘油三酯和總膽固醇含量。

1.4 數據統計分析

2 結果與討論

2.1 最佳顯色劑和最大吸收波長的確定(圖1)

從圖1可以看出，標準品-亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系的紫外吸收光譜多刺不光滑，且吸收峰個數較多，不適合作為洋蔥醇提物總黃酮含量測定的顯色劑。故采用三氯化鋁-醋酸-醋酸鈉緩沖溶液顯色劑，最大吸收波長為414 nm。

2.2 單因素實驗結果(圖2)

從圖2可以看出，當顯色溫度、顯色時間、0.1 mol·L-1AlCl3溶液用量、HAc-NaAc緩沖溶液用量分別為25 ℃、22 min、0.75 mL、1.10 mL時，吸光度最高。

圖2 單因素實驗結果Fig.2 Results of single-factor experiments

故顯色溫度、顯色時間、0.1 mol·L-1AlCl3溶液用量、HAc-NaAc緩沖溶液用量分別選取25 ℃、22 min、0.75 mL、1.10 mL較為適宜。

2.3 響應面實驗結果

2.3.1 響應面實驗設計及結果(表1)

表1 響應面實驗設計及結果

對表1數據進行擬合，得到回歸模型方程為：Y=0.3934-0.0020A+0.0290B+0.0001C-0.0069AB-0.0016AC-0.0030BC-0.0057A2-0.0102B2-0.0017C2。

回歸模型的方差分析見表2。

表2 回歸模型的方差分析

從表2可以看出，模型F=18.91，P=0.0004<0.01，極顯著；失擬項P=0.5761，不顯著，表明模型有意義。R2=0.9605，表明模型擬合較好。

2.3.2 響應面分析

各因素交互作用對吸光度影響的響應面圖及等高線圖如圖3所示。

從圖3可以看出，殘差的正態概率分布圖及預測值與實際值的分布圖接近一條直線，殘差與預測值的分布圖無序排列，僅顯色時間與0.1 mol·L-1AlCl3溶液用量的交互作用影響較顯著，響應面模型有意義。

圖3 各因素交互作用對吸光度影響的響應面圖及等高線圖Fig.3 Response surface plots and contour plots for effects of interaction between various factors on absorbance

根據回歸模型得到最佳顯色條件為：顯色時間27 min、0.1 mol·L-1AlCl3溶液用量1.00 mL、HAc-NaAc緩沖溶液用量0.90 mL。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線及線性范圍

分別精密量取0.075 mg·mL-1蘆丁標準溶液1.0 mL、0.8 mL、0.6 mL、0.4 mL、0.3 mL、0.2 mL于5 mL容量瓶中，加入1.00 mL 0.1 mol·L-1AlCl3溶液和0.90 mL HAc-NaAc緩沖溶液，用70%乙醇定容至刻度，常溫下顯色27 min，測定414 nm處吸光度。以蘆丁濃度 (c，mg·L-1)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線(圖4)，擬合得線性回歸方程為A=0.0606c+0.0214，R2=0.9958。表明，蘆丁濃度在3.0～15.0 mg·L-1范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

圖4 蘆丁的標準曲線Fig.4 Standard curve of rutin

2.4.2 精密度

分別吸取5份3.84 mg·mL-1供試溶液各1 mL于5 mL容量瓶中，在最佳顯色條件下，測得414 nm處吸光度分別為0.550 6、0.545 3、0.549 2、0.550 1、0.551 7，計算得到總黃酮含量(mg·g-1)分別為8.545 1、8.459 5、8.522 5、8.537 0、8.562 8，RSD值為0.4646%。表明，儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性

分別吸取6份3.84 mg·mL-1供試溶液各1 mL于5 mL容量瓶中，加入1.00 mL 0.1 mol·L-1AlCl3溶液和0.90 mL HAc-NaAc緩沖溶液，用70%乙醇定容至刻度，在常溫下分別放置20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min，測得414 nm處吸光度分別為0.536 0、0.541 8、0.544 7、0.541 6、0.542 6、0.540 4，計算得到總黃酮含量(mg·g-1)分別為8.309 3、8.403 0、8.449 8、8.399 7、8.415 9、8.380 4，RSD值為0.5603%。表明，供試溶液在室溫下120 min內穩定。

2.4.4 重復性

分別精密稱取6份洋蔥粉末各1.0 g，按1.2.3方法制備供試溶液。取供試溶液0.6 mL于5 mL容量瓶中，在最佳顯色條件下，測得414 nm處吸光度分別為0.658 8、0.662 3、0.664 7、0.661 6、0.664 4、0.666 9，計算得到總黃酮含量(mg·g-1)分別為8.664 1、8.711 7、8.744 3、8.702 2、8.740 3、8.774 2，RSD值為0.4411%。表明，該方法的重復性較好。

2.4.5 加標回收率

分別精密稱取6份洋蔥粉末各0.5 g，加入一定量的蘆丁標準溶液，按1.2.3方法制備供試溶液，在最佳顯色條件下測定414 nm處吸光度，計算加標回收率，結果見表3。

表3 加標回收率結果

2.5 實際樣品中總黃酮含量測定

分別吸取3份3.84 mg·mL-1供試溶液各1 mL，在最佳顯色條件下，測得414 nm處吸光度分別為0.546 4、0.559 4、0.559 8，計算得到總黃酮含量(mg·g-1)分別為8.477 2、8.687 2、8.693 6，總黃酮平均含量為8.619 3 mg·g-1，與預測值(8.364 3 mg·g-1)的相對誤差為2.96%。

2.6 降脂活性

2.6.1 洋蔥醇提物對HepG2細胞的毒性(圖5)

圖5 洋蔥醇提物對HepG2細胞的毒性Fig.5 Cytotoxicity of alcohol extract of Allium cepa L.to HepG2 cells

從圖5可以看出，與正常培養的陰性對照組相比，加入FFA后的不同處理組的細胞存活率均略微下降；與模型組相比，中、高濃度洋蔥醇提物組的細胞存活率差別不大，低濃度洋蔥醇提物組的細胞存活率略微上升。表明，中、高濃度洋蔥醇提物和FFA共同作用24 h對HepG-2細胞毒性沒有明顯的抑制作用。

2.6.2 細胞內甘油三酯和總膽固醇的含量

FFA誘導肝脂肪變性24 h后，通過油紅O染色判斷是否建模成功。結果發現，與陰性對照組相比，模型組細胞內脂質的積累明顯，洋蔥醇提物組細胞內脂質的積累均降低。繪制標準曲線，擬合得線性回歸方程：甘油三酯，y=0.0129x+0.0941，R2=0.9932；總膽固醇，y=0.0029x+0.0563，R2=0.9905；總蛋白，y=0.0001x+0.1608，R2=0.9978。計算細胞內甘油三酯和總膽固醇的含量，結果顯示，與陰性對照組相比，模型組細胞內甘油三酯和總膽固醇含量均顯著增加，洋蔥醇提物組則以劑量依賴方式抑制FFA誘導的甘油三酯和總膽固醇積累(圖6)。

注：與模型組比較，*表示P<0.05、**表示P<0.01、

2.7 討論

由于亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色劑不僅能與黃酮類化合物反應，還能與酚酸、原花色素等非黃酮類化合物反應，干擾測定結果，專屬性不強。因此，本研究選擇三氯化鋁-醋酸-醋酸鈉緩沖溶液作顯色劑，與陳愛洋等[17]選擇的顯色劑一致。王彩虹等[18]以蘆丁為標準品，采用三氯化鋁-亞硝酸鈉-氫氧化鈉顯色劑測定的洋蔥總黃酮含量為8.35 mg·g-1。本研究在單因素實驗的基礎上，進一步通過響應面法[19-20]優化顯色條件，測得洋蔥醇提物總黃酮含量為8.619 3 mg·g-1。

黃酮醇是洋蔥的主要黃酮類化合物，包括槲皮素、山萘酚、異鼠李素、楊梅黃酮及其衍生物[21-22]。研究表明，黃酮類化合物具有抗氧化、降脂以及改善代謝性綜合征等作用[8,23]。氧化應激的產生是脂質代謝紊亂的一大誘因，增加抗氧化劑的攝入量可能會降低肥胖的發生率[24]。Nuutila等[25]、Prakash等[26]已報道了洋蔥通過抑制脂質過氧化和清除自由基發揮抗氧化作用；作者所在課題組前期也證明了洋蔥醇提物及洋蔥皮醇提物具有一定的抗氧化作用[27-28]。此外，NAFLD的臨床病理特征是肝脂肪變性和脂肪堆積，Emamat等[9]和El-Din等[29]均研究發現，給大鼠喂食高脂肪飲食誘導NAFLD后，實驗組食用洋蔥可以正調節與NAFLD疾病相關的生化和組織學標志物。本研究中，通過FFA誘導HepG2細胞建立肝脂肪變性模型，油紅O染色表明建模成功；進一步實驗證明洋蔥醇提物在一定濃度范圍內有降低細胞內甘油三酯和總膽固醇含量的作用。并且，作者所在課題組前期研究發現，洋蔥醇提物可以通過下調HMGCR和上調LDLR來緩解SD大鼠的高脂血癥[14]。

3 結論

以三氯化鋁-醋酸-醋酸鈉緩沖溶液為顯色劑，采用紫外分光光度法測定洋蔥醇提物總黃酮含量，通過單因素實驗結合響應面法優化洋蔥醇提物總黃酮含量測定的顯色條件，確定最佳顯色條件為：顯色溫度25 ℃、顯色時間27 min、0.1 mol·L-1AlCl3溶液用量1.00 mL、HAc-NaAc緩沖溶液(pH值5.2)用量0.90 mL，在該顯色條件下，洋蔥醇提物總黃酮含量為8.619 3 mg·g-1，與預測值(8.364 3 mg·g-1)的相對誤差為2.96%。體外降脂實驗發現，與模型組相比，洋蔥醇提物使細胞內甘油三酯和總膽固醇含量降低，且高濃度組具有統計學差異(P<0.05)。洋蔥醇提物含有較豐富的黃酮類化合物，其降脂活性可能是黃酮類化合物異槲皮苷、槲皮素等與其它活性成分協同作用的結果，有望進一步研究開發用來防治非酒精性脂肪肝。