熒光偏振測定法在布魯氏菌病抗體檢測中的應(yīng)用

王玉恒，吉哈利，于子淇，旦增卓瑪

（1.西藏自治區(qū)獸醫(yī)生物藥品制造廠，西藏 拉薩 850000；2.西藏蓮莖生物科技有限公司，西藏 拉薩 850000）

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種以流產(chǎn)和發(fā)熱為主要臨床特征的人畜共患病，以牛、羊、豬等家畜最易感染[1-2]。該病具有傳染速度快、感染范圍大等特點，給人類身體健康和畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展帶來嚴(yán)重威脅[3-4]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。目前，布魯氏菌病的防控形勢依然十分嚴(yán)峻，前期抗體檢測是防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5-6]。

熒光偏振抗體檢測法（FPA）是檢測布魯氏菌病抗體的常用方法[7-8]。其原理是以分子旋轉(zhuǎn)特性為基礎(chǔ)，利用熒光偏振儀測量抗原與抗體結(jié)合后的旋轉(zhuǎn)速率，從而判定血清樣品中是否含有布魯氏菌病抗體[9-10]。目前，該檢測技術(shù)備受科研者及檢疫人員關(guān)注，已廣泛應(yīng)用于藥學(xué)[11-12]、生物學(xué)[13-14]、醫(yī)學(xué)[15-16]及動物醫(yī)學(xué)[17-18]等學(xué)科。但FPA測定法用于牦牛布魯氏菌病抗體檢測的研究鮮見報道。因此，本研究利用FPA測定法對129份牦牛血清進行布魯氏菌病抗體檢測，并與試管凝集試驗（SAT）進行數(shù)據(jù)比對，從而分析評價FPA測定法的性能，為布魯氏菌病抗體檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 血清 選取129 份牦牛血清樣品，置于西藏蓮莖生物科技有限公司檢測中心-20 ℃保存。

1.1.2 主要試劑 布魯氏菌病熒光偏振抗體檢測試劑盒，采購于哈爾濱平河生物技術(shù)有限公司，批號20211106；試管凝集試驗（SAT）陽性標(biāo)準(zhǔn)、陰性標(biāo)準(zhǔn)及抗原，均購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號20210716。

1.1.3 主要儀器 布魯氏菌熒光偏振檢測儀（哈爾濱平河生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)LUPO），恒溫培養(yǎng)箱（上海鴻都電子科技有限公司，SHP-300），高速冷凍離心機（湖南星科科學(xué)儀器有限公司，TGL16），微量振蕩器（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠，MH-2），生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，BSC-04B2），其他耗材均為國產(chǎn)。

1.2 檢測方法

1.2.1 試管凝集試驗 按照GB/T 18646-2018《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》進行操作及結(jié)果判定。

1.2.2 熒光偏振測定法 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作，取硼硅玻璃試管加入1 ml樣品稀釋液，再加入10 μl待檢牛血清樣品，充分振蕩混勻，測定樣品空白密度值；加入10 μl的FPA標(biāo)記抗原，充分振蕩混勻，測定樣品毫偏振值。在陽性標(biāo)準(zhǔn)、陰性標(biāo)準(zhǔn)成立的條件下，樣品毫偏振值＜95為陰性，96～116為可疑，＞116為陽性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

采用Microsoft Excel 2010版軟件中四格表法（表1）對FPA測定法與SAT試驗法的數(shù)據(jù)進行比較分析。

表1 評價診斷試驗的四格表法

2 結(jié)果與分析

采用熒光偏振抗體檢測法與試管凝集試驗對129份牦牛血清樣品進行布氏桿菌病抗體檢測。由表2可知，試管凝集試驗篩選出51份抗體陰性樣品和78份抗體陽性樣品，而熒光偏振抗體檢測法篩選出41份抗體陰性樣品和88份抗體陽性樣品。

表2 熒光偏振測定法檢測結(jié)果

以試管凝集試驗數(shù)據(jù)為參照，對熒光偏振抗體檢測法測定結(jié)果進行分析。由表3可知，熒光偏振抗體檢測法敏感性（100.00%）、特異性（80.39%）、符合率（92.25%）和約登指數(shù)（80.39%）較高，表明其診斷準(zhǔn)確性較好；陰性似然比值（0.00）和陰性預(yù)測值（100.00%）表明檢測結(jié)果陰性時為真陰性的概率高；陽性似然比值（5.10）和陽性預(yù)測值（88.64%）表明檢測結(jié)果陽性時存在假陽性的可能性。

表3 數(shù)據(jù)分析表

3 討論

目前，布魯氏菌病常規(guī)實驗室檢測方法有血清學(xué)和細菌學(xué)，但細菌學(xué)檢測對實驗室的生物安全要求條件高并存在一定安全隱患，因此布魯氏菌病常規(guī)檢測技術(shù)為凝集反應(yīng)、補體結(jié)合、沉淀反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗以及熒光偏振檢測方法等血清學(xué)方法[8]。2001年Nielsen和Gall根據(jù)熒光偏振原理建立了一種適用于布魯氏菌病檢測的FPA技術(shù)[9]。因FPA技術(shù)具有簡便、客觀、快速等優(yōu)點，得到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛研究[10-18]。OIE《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》將FPA技術(shù)指定為國際貿(mào)易試驗方法，我國也將FPA技術(shù)納入《2020年國家動物疫病監(jiān)測與流行病學(xué)調(diào)查計劃》。采用試管凝集試驗和熒光偏振抗體檢測法對129份牦牛血清樣品進行布氏桿菌病抗體檢測，結(jié)果顯示試管凝集試驗篩選出51份抗體陰性樣品和78份抗體陽性樣品，而熒光偏振抗體檢測法篩選出41份抗體陰性樣品和88份抗體陽性樣品。再根據(jù)試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示熒光偏振抗體檢測法的敏感性和陰性預(yù)測值均為100%，符合率達90%以上，特異性和約登指數(shù)均達80%以上，與任燕斌[19]、孫翠麗[20]研究結(jié)果基本一致，進一步表明熒光偏振抗體檢測法適用于牦牛血清的布魯氏菌病抗體檢測，且診斷準(zhǔn)確性較高。