Bacillus humi耐鹽及產表活劑性能研究

胡 敏，劉美嬌，曲麗娜，卞立紅，殷亞杰，張奕婷，徐晶雪，任國領

(大慶師范學院 生物工程學院，黑龍江 大慶 163712)

1 引言

近幾年，隨著油氣資源的不斷開發，原油的泄漏和污染事故頻頻發生，而生物修復是一種行之有效的方法[1]。許多采油菌都具有產表活劑的特性，因而在石油生產中有著十分重要的作用[2]。表面活性劑有增溶、乳化、潤濕、分散、使表面張力降低等特性，還具有無毒、生物降解、表面活性高等特點，在石油工業中有著廣泛的應用前景[3]。由于大慶油田的油層環境非常復雜，且常常是高鹽環境，所以采油微生物具有耐鹽和產表活劑的性能是十分必要的[4]。生物表面活性劑能加速原油的分解，并能降低原油的表面張力，改變微生物的膜結構，加速微生物與原油的接觸，增強微生物對原油的利用[5，6]。

在產表活劑的微生物中，以假單胞菌和芽孢桿菌(G+)研究的最多[7]。Bacillus humi(土地芽孢桿菌)是中等酸性土壤中的一種促進植物生長的桿菌，是一種革蘭氏陽性需氧芽孢桿菌。該菌細胞薄，微彎曲，圓端，高度活躍的桿狀細胞，單獨出現或成對出現[8-10]。芽孢桿菌具有優良的耐鹽等抗逆性，其耐鹽機制是通過調節自身耐鹽基因的表達來實現的[11]。本研究對油藏采出水分離并鑒定的Bacillus humi菌株的耐鹽及產生物表面活性劑的性能進行了分析，為該菌的進一步利用提供參考。

2 材料與方法

2.1 材料

Bacillus humi菌株、原油。

2.2 主要試劑與培養基

無機鹽溶液：NaCl 0.5%、(NH4)2SO40.1%、MgSO40.025%、NaNO30.2%、NaH2PO40.5%、Na2HPO41.0%[4]。

LB培養基：蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，NaCl 2 g，200 mL蒸餾水。葡萄糖耐鹽培養基：無機鹽溶液中添加原油4%、酵母粉0.05%，固體葡萄糖耐鹽培養基需添加2%瓊脂。耐鹽降油培養基：無機鹽溶液中添加原油0.1%[4]。發酵培養基：葡萄糖5 g，酵母粉1 g、蛋白胨2 g、pH=7，蒸餾水1000 mL[11]。

所有的培養基使用前均經過120 ℃高壓蒸汽滅菌處理20 min。

2.3 菌種活化

將菌株接種在200 mL的LB培養基中，置于43 ℃、120 rpm的搖床中培養24 h，將培養后的菌液于4 ℃冰箱內保存，備用。

2.4 Bacillus humi菌株耐鹽特性研究

2.4.1 不同鹽濃度下菌株的生長情況

菌液以2%的接種量接入含原油4%的鹽濃度為0%、2%、5%、10%、15%的葡萄糖耐鹽培養基中，置于搖床中43 ℃、120 r/min培養6 d，分別在2～6 d取樣涂布平板計算活菌數。

2.4.2 不同鹽濃度下微生物對原油的降解作用

菌液以10%的接種量接入含原油0.1%的鹽濃度為0%、2%、5%、10%、15%的耐鹽降油培養基中，置于搖床中43 ℃、120 rpm培養5 d。將培養后的液體樣品置于分液漏斗中，加入30 mL正己烷進行萃取，振蕩，靜置3 min。選定256 nm的波長處，用10 mm石英比色皿，以正己烷為參比，測量其吸光度[12]。

2.5 Bacillus humi產表活劑性能研究

乳化指數(E24)與表面活性劑的濃度成正比，測定在不同溫度、pH值、鹽濃度條件下菌株培養液乳化指數(E24)的大小，以探究不同培養條件對菌株產生表面活性劑能力的影響。將培養后的液體10000 r/min離心20 min去除菌體，取已去除菌體的菌株培養液和液體石蠟各5 mL分別加入尖頭離心管中，漩渦震蕩2 min 混合均勻，室溫靜置 24 h 后測量其乳化層高度，并按照下式計算E24[13]：

(1)

式(1)中：he為乳化層高度(cm)；h為液體總高度(cm)。

2.5.1 菌株產生物表面活性劑的最適溫度的研究

菌株以10%的接種量接種至發酵培養基中培養，分別在27 ℃、32 ℃、37 ℃、43 ℃、47 ℃，120 r/min的搖床中培養48 h，取樣測定菌株培養液的E24。

2.5.2 菌株產生物表面活性劑的最適pH值的研究

發酵培養基其他成分不變，調節pH值分別為7、8、9、10、11、12、13，菌株以10%的接種量接種至不同pH的發酵培養基中，置于43 ℃、120 r/min的搖床中培養48 h，取樣測定菌株培養液的E24。

2.5.3 菌株產生物表面活性劑的耐鹽性能的研究

發酵培養基的其他成分不變，按 照0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%的質量分數添加 NaCl，將菌株以10%的接種量接種至不同鹽度的發酵培養基中，置于43 ℃、120 r/min的搖床中培養48 h，取樣測定菌株培養液的E24。

3 結果與分析

3.1 Bacillus humi耐鹽性能結果與分析

3.1.1 不同鹽濃度下菌株的生長情況

在2%的鹽濃度下，培養2 d后，菌體濃度達到1.08×106cfu/mL，然后菌體濃度下降，在第5天和6天時，菌體濃度下降到低于鹽濃度為0時的水平。這表明，盡管在葡萄糖耐鹽培養基中，較高的鹽濃度會顯著促進Bacillus humi菌株的生長，但該效應會加快Bacillus humi菌株的代謝，從而加速進入衰亡期。當鹽濃度為10%和15%時，Bacillus humi菌株的生長受到嚴重的抑制，至第4天后菌體開始生長，這表明Bacillus humi菌株對高鹽環境具有一定的耐受性。因此， 0%～2%的鹽濃度范圍內Bacillus humi菌株有較好的生長，當鹽濃度大于5%以后，對其生長有所抑制(表1和圖1)。

圖1 不同鹽濃度下菌株的生長情況

表1 Bacillus humi菌株在葡萄糖耐鹽培養基培養生長的菌落數 cfu/mL

大慶鹽堿地的土壤含鹽量高，較高的鹽濃度會顯著地抑制油田中的微生物生長。無機鹽對細菌的生長有兩方面的影響：一是在高鹽分的環境條件下，細胞出現脫水現象，使其生長速率降低，最后導致細胞的死亡；二是一些金屬元素對微生物來說是微量元素，當鹽含量過高時，會對細胞產生一定的毒性，使其生長速度減慢，甚至使細胞死亡[14]。實驗結果表明，鹽濃度對Bacillus humi菌株的生長有一定的影響。

3.1.2 不同鹽濃度下微生物對原油的降解作用

不同的石油降解菌對于石油中各種烴類的降解能力不盡相同，大部分細菌僅能降解一種或多種烴類，可以通過正己烷萃取后溶液中烴類的含量來分析該菌株對原油的降解程度。根據Bacillus humi菌株在不同鹽濃度下的吸光度測定發現，在鹽濃度為5%時測定的吸光度最高，OD值為2.23，與鹽濃度為2%和10%的OD值無顯著性差異，但顯著高于鹽濃度為0%的OD值和15%的OD值(P=0.052)。在5%的鹽濃度下，原油中烴類的溶解性增加，由原來的疏水狀態轉變為親水狀態，導致正己烷中烴類含量增加，因此測定的吸光度值最高。由此可以推斷出，在5%的鹽濃度下Bacillus humi菌株對原油的降解效果最好。15%鹽濃度下的菌株培養液在培養過程中，大部分原油凝聚在三角瓶壁上，原油中的烴類沒有得到較好的溶解，因此最終測定的吸光值有一個較低的趨勢(表2、表3、圖2)。

表2 搖瓶油降解實驗現象

表3 正己烷萬烷萃取后上清液OD值

圖2 鹽濃度對OD值影響的結果

3.2 Bacillus humi產表活劑性能結果與分析

表面活性劑能增大石油烴類物質在水相中的溶解度，提高污染物在土壤中的傳遞速率和生物可利用性，進而促進降解。產表面活性劑的性能弱、營養組分的減少、溶解氧的降低、有毒物質的積累、菌體濃度的大幅度下降，是影響石油降解率持續增長的幾個主要原因[15]。

3.2.1 菌株產生物表面活性劑的最適溫度的研究

由表4和圖3可知，溫度對微生物的生長和產生物表面活性劑的能力有一定的影響。由實驗結果可知，Bacillus humi菌株培養液的整體E24在37.5%～40.0%范圍內。在43 ℃條件下菌株培養液的E24顯著高于27 ℃和32 ℃條件下的E24，但與37 ℃和47 ℃條件下菌株培養液的E24無顯著性差異，43 ℃時E24=40.0%最高，在這個溫度下，菌體的生長和代謝速度最快，產表面活性劑濃度最高。同時也說明，Bacillus humi菌株在27～47 ℃的溫度范圍內都能很好的繁殖和產生物表面活性劑，產表活劑濃度最適范圍為37～47 ℃。

表4 不同溫度條件下培養液的乳化指數(E24)

圖3 不同溫度條件下的培養液乳化指數(E24)

3.2.2 菌株產生物表面活性劑的最適pH值的研究

由表5和圖4可知，pH值與菌株產生物表面活性劑密切相關。不同pH值培養條件下菌株培養液的整體E24在36.4%～42.4%之間，菌株Bacillus humi在堿性較高的環境中仍可產生物表面活性劑。pH值為 7、8、9的條件下菌株培養液的E24無顯著性差異，pH值為8條件下菌株培養液的E24=42.4%顯著高于pH值為7、9、10、11、12、13的E24。結果表明： Bacillus humi菌株產表活劑的最佳pH值是8，pH 值為7～9時生物表面活性劑的產率均較高。

表5 不同pH條件下培養液的乳化程度

圖4 不同pH值條件下的培養液乳化指數(E24)

3.2.3 菌株產生物表面活性劑的耐鹽性能的研究

由表6和圖5可知，不同NaCl濃度培養條件下菌株培養液的整體E24在36.7%～40.6%之間，當NaCl濃度為0%、1%、7%、8%、9%時，菌株培養液的E24無顯著性差異。在NaCl濃度為3%條件下，該菌株培養液的E24=40.6%顯著高于其他NaCl濃度下菌株培養液的E24。由此可見，Bacillus humi菌株產生物表面活性劑的最適NaCl濃度為3%，在NaCl濃度為2%～4%條件下產生物表面活性劑能力均較強。當NaCl的含量超過4%時，Bacillus humi菌株產生物表面活性劑的能力會受到影響，但差異仍不顯著。

圖5 不同NaCl濃度條件下的培養液乳化指數(E24)

表6 不同NaCl濃度條件下對培養液乳化指數(E24)的影響

4 結論

Bacillus humi菌株是從大慶油藏采出水中篩選出來的土地芽孢桿菌，在耐鹽性能實驗中，主要對Bacillus humi菌株的耐鹽能力和在不同鹽濃度下對原油的降解情況進行的研究。結果表明：鹽濃度對該菌株的生長和原油降解均有較明顯的影響，在0%～2%的鹽濃度下最適生長，在5%的鹽濃度下對原油的降解效果最好。Bacillus humi菌株表現出較好的耐鹽性及高效原油降解效率，具有修復原油污染鹽漬化土壤的應用潛力。

在Bacillus humi產表活劑性能實驗中，測定在不同培養溫度、pH值、鹽濃度條件下Bacillus humi菌株培養液乳化指數(E24)的大小，以探究不同培養條件對菌株產生表面活性劑能力的影響。結果表明：Bacillus humi菌株生長的最佳溫度為43 ℃，在此溫度下產生物表面活性劑的能力最強，最適生長范圍為37～47 ℃；產生物表面活性劑的最適pH值為8，在pH值7～9條件下產生物表面活性劑能力均較強；產生物表面活性劑的最適NaCl濃度為3%，在NaCl濃度為2%～4%條件下產生物表面活性劑能力均較強，在最適條件下Bacillus humi菌株產生物表面活性劑的E24均達到40%，具有很強的產生物表面活性劑的特性，在實際應用中具有強大的競爭力和明顯的優越性。