基于p38 MARK 信號通路探討益氣生肌合劑聯(lián)合三乙醇胺乳膏對壓瘡大鼠模型皮損及血清炎癥因子的影響

唐玉利 劉欣 廖若夷

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科，湖南長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院護理部，湖南長沙 410208

壓瘡嚴重降低了患者生存質(zhì)量[1-2]。單純運用負壓引流治療壓瘡臨床效果仍欠佳[3-4]。中醫(yī)學(xué)中壓瘡應(yīng)屬“席瘡”范疇[5]，運用中西醫(yī)結(jié)合治療本病可取得較好效果[6-7]。益氣生肌合劑臨床應(yīng)用多年，在創(chuàng)面修復(fù)中取得較好療效，本研究進一步探討其對壓瘡大鼠模型皮損、血清炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50 只SPF 級SD 大鼠，雌雄各半，6～7 周齡，180～200 g，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004，合格證號：43072663411 014472，自由攝食。

1.2 實驗藥物

益氣生肌合劑由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供（批號：20210105，規(guī)格100 g/瓶）；三乙醇胺乳膏[法國Biafine Act 公司生產(chǎn)，注冊號：（進）H20120425，規(guī)格：46.5 g/支]。

1.3 主要試劑與儀器

p38 絲裂素活化蛋白激酶（p38mitogen-activatedproteinkinase，p38 MARK）抗體（CST，批號：8690P）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體（CST，批號：65373P）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases，MMP-9）抗體（CST，批號：D6O3H）；PBS（Hyclone，貨號：80334412）；酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）IL-2、IL-12、CRP 試劑盒（武漢博士德生物，貨號：EK0404、EK0421、EK1316）。蛋白電泳儀（北京六一，型號：DYY-2C），其余儀器耗材由實驗室提供。

1.4 動物分組

將大鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、三乙醇胺乳膏組、益氣生肌組、聯(lián)合用藥組，每組10 只。

1.5 壓瘡大鼠模型的建立

參照姜麗萍等[8]的壓瘡大鼠模型建立方法制備壓瘡大鼠模型，假手術(shù)組僅同部位埋入磁鐵不予壓力裝置加壓。

1.6 動物給藥

根據(jù)人等效劑量換算[9]將大鼠益氣生肌組給藥劑量設(shè)定為12.98 g/（kg·d）。假手術(shù)組與模型組給予生理鹽水0.4 ml 灌胃；三乙醇胺乳膏組大鼠予三乙醇胺乳膏外用，2 次/d；益氣生肌組予益氣生肌合劑灌胃，1 次/d；聯(lián)合用藥組為上述藥物聯(lián)合使用各組均連續(xù)干預(yù)8 d。

1.7 標本采集

最后一次給藥1 h 后，于眼眶處取血約1.0 ml，4℃環(huán)境下1 500 r/min 離心5 min，離心半徑16 cm，取上清置于-20℃冰箱備檢。斷頸處死后取各組大鼠皮損部位組織備檢。

1.8 觀察指標

1.8.1 形態(tài)學(xué)觀察 觀察各組大鼠干預(yù)前后的皮損情況，皮損面積（cm2）計算方法為最大長度（cm）×最大寬度（cm）。

1.8.2 病理觀察 取各組大鼠皮損組織制備石蠟切片，蘇木精-伊紅染色后顯微鏡下觀察病理情況。

1.8.3 血清炎癥因子檢測 ELISA 測定各組大鼠血清白細胞介素（interleukin，IL）-2、IL-12、C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）水平。嚴格按照試劑盒說明書操作，借助酶標儀進行檢測。

1.8.4 p38 MARK 信號通路蛋白檢測 提取各組大鼠皮損組織總蛋白，加入SDS 緩沖液煮沸5 min 使蛋白變性。凝膠電泳轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉孵育1 h，添加一抗抗體p38 MARK（1∶5 000）、VEGF（1∶500）、MMP-9（1∶1 000）和β-actin(1∶1 000），4℃過夜，TBST 洗膜3 次，每次5 min。室溫孵育二抗2 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min。顯色后以β-actin 作為內(nèi)參，計算各蛋白灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組創(chuàng)面形態(tài)學(xué)觀察

干預(yù)8 d 后，假手術(shù)組大鼠皮膚創(chuàng)面結(jié)痂已脫落，皮膚顏色恢復(fù)正常；模型組大鼠見壓瘡皮損愈合緩慢，其余各組大鼠的壓瘡皮損均存在不同程度的愈合結(jié)痂。見圖1。

圖1 各組創(chuàng)面形態(tài)學(xué)情況

2.2 各組皮損面積比較

假手術(shù)組大鼠的創(chuàng)面在第8 天已完全愈合。三乙醇胺乳膏組、益氣生肌組、聯(lián)合用藥組造模第8 天皮損面積低于模型組，聯(lián)合用藥組造模第8 天皮損面積低于三乙醇胺乳膏組、益氣生肌組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組皮損面積比較（cm2，）

表1 各組皮損面積比較（cm2，）

注 與模型組比較，aP＜0.05；與三乙醇胺乳膏組比較，bP＜0.05；與益氣生肌組比較，cP＜0.05

2.3 各組皮損組織病理學(xué)情況

假手術(shù)組皮損組織細胞結(jié)構(gòu)排列整齊，未見炎性浸潤。模型組皮損組織周圍存在明顯的炎性浸潤及壞死碎片，組織可見明顯的空泡變性；其余各組可見皮損組織炎性浸潤明顯緩解，壞死碎片及空泡化現(xiàn)象明顯減少，其中聯(lián)合用藥組緩解程度最佳。見圖2。

圖2 各組皮損組織病理學(xué)情況（HE 染色，200×）

2.4 各組血清炎癥因子水平比較

模型組IL-2、IL-12、CRP 血清炎癥因子水平高于假手術(shù)組（P＜0.05）；三乙醇胺乳膏組、益氣生肌組、聯(lián)合用藥組IL-2、IL-12、CRP 血清炎癥因子水平均低于模型組，且聯(lián)合用藥組低于三乙醇胺乳膏組、益氣生肌組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組血清炎癥因子水平比較（n=10）

2.5 各組皮損組織p38 MARK、VEGF、MMP-9 的蛋白表達情況

模型組皮損組織p38 MARK、VEGF、MMP-9 蛋白表達水平高于假手術(shù)組（P＜0.05）。三乙醇胺乳膏組、益氣生肌組、聯(lián)合用藥組皮損組織p38 MARK、VEGF、MMP-9 蛋白表達水平均低于模型組，且聯(lián)合用藥組皮損組織p38 MARK、VEGF、MMP-9 蛋白表達水平低于三乙醇胺乳膏組、益氣生肌組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組皮損組織p38 MARK、VEGF、MMP-9 的蛋白表達情況（n=10）

3 討論

壓瘡多以局部肌膚壞死潰瘍，創(chuàng)面遷延難愈等為特征[10-11]。中醫(yī)學(xué)認為本病治療的總體原則為扶正祛邪，標本兼治[12-16]。p38 MAPK 信號通路與壓瘡的炎性機制聯(lián)系緊密，p38 MAPK 信號通路激活后，IL-2、IL-12、CRP、腫瘤壞子因子-α 等炎癥因子大量釋放，對皮損組織的病理性重構(gòu)起到了極為重要的調(diào)控作用[17-19]。與p38 MAPK 信號通路密切相關(guān)的VEGF、MMP-9 等因子所介導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖，參與了結(jié)締組織增生與局部的血管重建與再塑，同時p38 MAPK 信號通路能夠密切參與到細胞增殖、分化、凋亡及相關(guān)炎癥反應(yīng)中[20-23]。MMP-9、VEGF 是受p38 MAPK 信號通路調(diào)控的對細胞損傷與修復(fù)起重要調(diào)控作用的細胞因子[24]。p38 MAPK 信號通路緊密參與到細胞增殖、分化、凋亡及多種關(guān)鍵細胞因子合成等方面，在壓瘡的諸多生理病理調(diào)控中起到關(guān)鍵作用，是壓瘡的損傷與修復(fù)過程中的關(guān)鍵分子機制之一[25-26]。本研究治療壓瘡提供新的思路與基礎(chǔ)研究證據(jù)。

綜上所述，益氣生肌合劑與三乙醇胺乳膏聯(lián)用可有效修復(fù)壓瘡大鼠模型皮損，降低血清炎癥因子水平，其可能與益氣生肌合劑調(diào)控p38 MAPK 信號通路密切相關(guān)。