新型蒙藥脈瀉劑甘露養心丸含量測定及顯微鑒別研究

包順茹 娜仁圖雅 烏云索德 高 磊 韓塔娜

內蒙古自治區藥品檢驗研究院內蒙古自治區中蒙藥標準研究重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010010

甘露養心丸為內蒙古國際蒙醫院的院內協定處方，由西紅花、沙棘、黃芪等29 味藥材組成。具有養心、通脈、利尿、平喘、助胃火的功效。主要治療慢性心力衰竭、水腫、氣喘、脈管栓塞等[1-3]。此方在傳統脈瀉制劑的基礎上，對處方進一步優化，使其成為處方藥味均為治療心血管病種的新型脈瀉制劑。該制劑突破傳統心血管疾病的組方慣例，根據臨床病例資料分析，證明其是以利尿，通脈，脈瀉為主要方式達到治療慢性心力衰竭心臟病的效果。該制劑初始標準較低，沒有定性、定量標準，為了更好地控制其質量，本研究建立了甘露養心丸中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的總含量測定方法[4-8]及處方中海金沙、沙棘、葶藶子、黃芪、西紅花、螃蟹、小蜀季花和山沉香的顯微鑒別方法[4.9-17]。該方法為原料藥基原、投藥量的準確和工藝的穩定提供了保障。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AE-100 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；ME 5 型電子天平（賽多利斯儀器有限公司），LEICA DM3000 生物顯微鏡（德國徠卡）。

1.2 試藥

甘露養心丸（內蒙古自治區國際蒙醫院，批號：20171204、20181143、20190731、20191229、20200429）。牛蒡子（貨號：1704001）、茯苓（貨號：1708001）、葶藶子（貨號：1712001）、芒硝（貨號：1705001）、石榴皮（貨號：1704001）、海金沙（貨號：1704001）、白豆蔻（貨號：1710001）、蓽茇（貨號：1707001）、香附（貨號：1803001）、赤芍（貨號：1702001）、肉豆蔻（貨號：1704001）、山柰（貨號：1508001）、黃芪（貨號：1701001）、紅參（貨號：1703001）、小茴香（貨號：1711001）、滑石粉（貨號：1705001）、車前子（貨號：1711001）、炒蒺藜（貨號：1803001）、肉桂（貨號：1704001）均購自內蒙古瑞泰藥業有限公司；山沉香（貨號：C17120701）、赤瓟子（貨號：C180606）均購自安國潤德藥業有限公司；五味子（貨號：18033002）購自內蒙古慕昕藥業有限公司，白硇砂（貨號：170801）；冬青葉（貨號：170801）、小蜀季花（貨號：170801）、方海（貨號：170801）、沙棘（貨號：170801）、廣棗（貨號：170801）均購自安國路路通中藥飲片有限公司。西紅花苷-Ⅰ對照品（批號：111588-201704，純度：88.4%）、西紅花苷-Ⅱ對照品（批號：111589-201705，純度：92.2%）購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純，乙醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（45∶55）；檢測波長為440 nm；流速為1.0 ml/min；柱溫為30℃；進樣量：10 μl。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ對照品適量，加稀乙醇制成濃度分別為0.259 2、0.100 8 mg/ml 的混合對照品儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取供試品，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）20 min，取出，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 陰性對照溶液的制備 按處方工藝制備不含西紅花的陰性樣品，按“2.1.3”項下方法制備陰性對照溶液。

2.1.5 專屬性考察 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液，測定。結果顯示該方法陰性無干擾，專屬性好。見圖1。

圖1 甘露養心丸、對照品、陰性對照溶液色譜圖

2.1.6 線性關系考察 分別精密量取混合對照品儲備液0.2、0.5、0.8、1.2、1.6、2.0 ml 置10 ml 量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別測定，以對照品濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，西紅花苷-Ⅰ在5.184～51.837 μg/ml 范圍內，西紅花苷-Ⅱ在2.015～20.154 μg/ml 范圍內呈良好的線性關系。回歸方程分別為：Y=63 385.02X+1 216.36，r=1.000 0；Y=755 36.94X+5 175.98，r=1.000 0。

2.1.7 精密度試驗 取供試品（批號：20171204），按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，連續進樣6 次。西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ峰面積RSD 分別為0.22%、0.38%，精密度良好。

2.1.8 重復性試驗 取同一批號供試品（批號：20171204）6 份，各約0.5 g，精密稱定，分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，測定。西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ總含量的RSD 為1.26%，重復性良好。

2.1.9 穩定性試驗 取供試品溶液（批號：20171204），分別于制備后0、4、8、12、16、20、24 h 測定，以西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的峰面積值計，RSD 分別為0.47%和0.83%，提示供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.1.10 加樣回收試驗 取同一批號供試品（批號：2017 1204，含西紅花苷-Ⅰ0.904 mg/g、西紅花苷-Ⅱ0.276 mg/g）9 份，各約0.25 g，精密稱定，分別精密加入西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ混合對照品溶液5、10、15 ml（西紅花苷-Ⅰ濃度為23.440 μg/ml，西紅花苷-Ⅱ濃度為7.039 μg/ml），再精密加稀乙醇20、15、10 ml，按“2.1.3”項下方法進行處理，測定。見表1。結果提示該方法準確度良好。

表1 加樣回收試驗測定結果（n=9）

2.1.11 樣品含量測定 取樣品按上述方法操作并測定（n=2），5 批樣品的西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的總含量分別為1.180 mg/g（批號：20171204）、1.369 mg/g（批號：20181143）、1.356 mg/g（批號：20190731）、2.641 mg/g（批號：20191229）、2.560 mg/g（批號：20200 429）。

2.2 顯微鑒別試驗

取5 批次樣品，研細，制片，置顯微鏡下檢視。選擇鏡檢率高，專屬性強的藥材鑒別特征建立了顯微鑒別方法。

具體顯微特征歸屬：孢子淡黃色，為四面體、三角狀圓錐形，外壁有顆粒狀雕紋（海金沙）。盾狀毛由數十個單細胞毛毗連而成，末端分離，棕黃色，多破碎成扇形（沙棘）。種皮內表皮細胞黃色，多角形或長多角形，壁稍厚（葶藶子）。纖維成束散離，壁厚，表面有縱裂紋，兩端斷裂成帚狀或較平截（黃芪）。花粉粒無色或淡黃色，呈圓球形，表面有稀疏的細小刺狀雕紋（西紅花）。不規則碎片淡黃色或無色，表面有的可見細密波狀或直或網狀紋理（螃蟹）。花粉粒呈圓球形，外壁表面有短刺（小蜀季花）。木射線細胞淡黃色至黃色，徑向面觀長方形，壁略連珠狀增厚，切向面觀寬1～2 列細胞，高4～13 列細胞，有的射線細胞含棕黃色物（山沉香）。見圖2。

圖2 甘露養心丸顯微鏡下表現

3 討論

西紅花苷是西紅花的重要有效活性成分，具有顯著的抗心血管疾病的藥理活性[18-23]。因此本研究選取西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ作為含量指標來控制甘露養心丸的質量。

在供試品溶液制備過程中，考察了提取溶劑稀乙醇量10、15、20、25、50 ml，隨著提取溶劑量的增多，西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的總含量也隨之增多，但提取溶劑量為25、50 ml 時，含量相差不大，考慮綠色環保經濟因素，提取溶劑量定為25 ml。

測得的5 批樣品含量數據中，3 批樣品含量值較低，可能與原藥材來源有關[24-26]，因而在制劑配方中應該保證原藥材來源的穩定與可靠，以保障臨床治療效果。

該制劑為所有藥材原粉入藥，因而建立專屬性強的顯微鑒別方法即可以有效控制部分藥材的質量，檢驗方法簡單易行，且經濟實用。