水牛TRAIL基因克隆及生物信息學分析

徐媛媛，莫 霞，黃晨茜，馮 超，陸杏蓉，馬小婭，楊春艷，鄭海英，尚江華

(1.中國農業科學院廣西水牛研究所，廣西水牛遺傳繁育重點實驗室，南寧 530001; 2.農業農村部水牛遺傳繁育技術重點實驗室，南寧 530001)

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)是在1975年由Carswell等[1]發現的一種能使腫瘤細胞凋亡、壞死的細胞因子。細胞凋亡是一個內在的和基本的生物學過程，在多細胞有機體的發展和組織穩態的維持中起著關鍵的作用[2]。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是TNF超家族成員之一，是1995年由Wiley發現并命名的[3]。1996年，Pitti等[4]進一步證實并命名該分子為Apo2L。在哺乳動物中，TNF超家族成員主要包括TNF-α、Fas配體和Apo2L/TRAIL[4-6]。TRAIL通過2個不同的受體(TNFR1、TNFR2)啟動不同的細胞效應，包括細胞的生長、存活、活化、增殖、分化和死亡[7-8]。TRAIL廣泛表達于正常人的各種組織(肺臟、腎臟、脾臟、胸腺、前列腺、卵巢、小腸、外周淋巴細胞、心臟、胎盤、骨骼肌等)中，但在腦、肝臟和睪丸中未檢測到表達[3,9-11]。TRAIL是一個促凋亡配體，其作用在多種類型的疾病中表現突出，如非小細胞肺癌[12]、骨肉瘤[13]、肝細胞癌[14]、結直腸癌[15]、腎臟疾病[16]、白血病[17]等，但對正常細胞無明顯毒性。因此，關于TRAIL抗腫瘤作用的研究較多，而在動物生長發育中的作用研究甚少。Song等[18]通過體內外試驗證明，NG和Apo2L聯合治療能夠通過激活腫瘤組織中的細胞凋亡來抑制神經膠質瘤的生長。Zhang等[19]研究表明，TRAIL能夠誘導食管鱗狀細胞癌中PD-L1的表達，促進上皮-間質轉化。

水牛(Bubalusbubalis)在中國南方農業產業結構中占有非常重要的地位。隨著規模化養殖的逐漸發展，對水牛繁殖率的要求越來越高，但是目前中國水牛的繁殖周期長，繁殖率低于其他哺乳動物，而繁殖率的高低取決于母體卵巢卵泡的生長發育。因此，研究影響水牛卵泡發育及卵泡閉鎖的因素至關重要。研究表明，顆粒細胞是卵泡晚期閉鎖的最重要影響因素，卵巢顆粒細胞的凋亡影響卵泡生長、發育，而顆粒細胞的生長和凋亡受多種基因及信號通路的調控[20-22]。研究顯示，TRAIL可影響豬卵泡顆粒細胞中的卵泡發育，TRAIL/DcR1(decoyreceptor-1)能夠抑制卵巢顆粒細胞的凋亡，閉鎖卵泡顆粒細胞中TRAIL表達量顯著升高，而其受體DR4蛋白水平升高不明顯，TRAIL-DcR1表達量顯著降低。TRAIL及其受體通過激活Caspase-3誘導顆粒細胞凋亡，而DcR1則抑制TRAIL及其受體誘導的細胞凋亡[23]。推測TRAIL及其受體可能參與水牛卵巢顆粒細胞凋亡，進而影響水牛卵泡發育。鑒于此，本研究擬對水牛TRAIL基因進行克隆及生物信息學分析，以期為探究TRAIL信號通路對水牛卵巢卵泡發育及顆粒細胞的增殖和凋亡的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

廣西本地水牛——沼澤型水牛卵巢組織樣品采自廣西南寧屠宰場，―80 ℃保存備用。Trizol Reagent(15596018)購自Ambion公司；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)、PremixTaqTM(ExTaqTMVersion 2.0 plus Dye RR902A)、DL1000 DNA Marker(3591Q)、pMD18-T 載體(6011)均購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；大腸桿菌DH5α感受態細胞購自北京全式金生物科技有限公司；膠回收試劑盒(D2500-02)購自Omega公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及合成 參照NCBI上公布的水牛TRAIL基因序列(GenBank登錄號：XM_006068410.4)，采用Snapgene軟件設計1對用于水牛TRAIL基因CDS區序列的克隆引物，引物序列為：F：5′-ATGGGCCTGAAGCAGGCT-3′；R：5′-GCGCTTAGCCAATTAAAAAGGCTCCG-3′。引物由擎科生物科技有限公司合成。

1.2.2 總RNA提取和反轉錄 利用Trizol法提取水牛卵巢組織總RNA，并用NanoDrop 2000檢測其濃度和質量(D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0)，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。參照反轉錄試劑盒PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書將RNA反轉錄為cDNA，―20 ℃保存備用。

1.2.3TRAIL基因CDS區克隆及測序分析 以沼澤型水牛卵巢組織cDNA為模板進行PCR反應。PCR反應體系50 μL：上、下游引物各1.25 μL，PremixTaqTM25 μL，cDNA模板2.5 μL，ddH2O補至50 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸5 min。取50 μL PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物經膠回收純化后，與pMD18-T載體連接，連接體系10 μL：pMD18-T 1 μL，目的片段4 μL，Solution Ⅰ 5 μL。16 ℃金屬浴連接1 h。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，在含有氨芐青霉素的LB固體培養基上37 ℃培養14 h。挑取單克隆后，將其置于含有氨芐青霉素的LB液體培養基中繼續培養，通過菌液PCR驗證后，將陽性菌液送至擎科生物科技有限公司進行雙向測序。

1.2.4TRAIL基因核苷酸序列、氨基酸序列相似性比對和系統進化樹構建 使用DNAStar軟件中MegAlign程序對水牛、牦牛(登錄號：XM_005889917.2)、普通牛(登錄號：NM_001319901.1)、山羊(登錄號：XM_005675308.3)、綿羊(登錄號：XM_004003150.5)、馬(登錄號：NM_001297473.1)、野豬(登錄號：NM_001024696.1)、人(登錄號：NM_003810.4)、黑猩猩(登錄號：XM_008957310.3)和家鼠(登錄號：NM_009425.2)的TRAIL基因CDS區序列進行相似性比對；利用Mega 6.0軟件構建系統進化樹；使用GENE-DOC軟件對水牛、牦牛、普通牛、山羊、綿羊、馬、野豬、人、黑猩猩和家鼠的TRAIL蛋白的氨基酸序列進行比對。

1.2.5 生物信息學分析 利用PortParam和PortScale在線軟件分析TRAIL蛋白的理化性質、親/疏水性；利用TMHMM 2.0和SMART在線軟件預測TRAIL蛋白的跨膜區和結構域；利用NetPhos 3.1、NetNGlyc 1.0和NetOGlyc 4.0在線軟件預測TRAIL蛋白的磷酸化位點和糖基化位點；采用SignalIP 4.1程序和PSORT Ⅱ Prediction預測TRAIL蛋白的信號肽切割位點和亞細胞定位；通過GORIV和SWISS-MODEL軟件分別預測TRAIL蛋白的二級結構和三級結構，詳細信息見表1。

表1 生物信息學分析網址Table 1 Bioinformation websites

續表

2 結 果

2.1 TRAIL基因CDS區克隆及序列分析

以反轉錄得到的水牛卵巢cDNA為模板，PCR擴增水牛TRAIL基因CDS區，結果表明，擴增出的目的條帶與預期長度相符(圖1)。通過測序和序列拼接得到長864 bp的水牛TRAIL基因CDS序列，編碼287個氨基酸。通過NCBI在線BLAST程序比對發現，本試驗克隆的水牛TRAIL基因CDS區與GenBank公布的序列(登錄號：XM_006068410.4)一致，表明成功擴增水牛TRAIL基因mRNA序列。

2.2 TRAIL基因核苷酸序列、氨基酸序列相似性比對及系統進化樹構建

核苷酸序列比對結果顯示，水牛TRAIL基因與普通牛、牦牛、綿羊、山羊、馬、野豬、人、黑猩猩和家鼠的核苷酸序列相似性分別為99.3%、99.2%、96.3%、95.9%、84.8%、84.7%、81.3%、81.3%和70.0%(圖2)。通過Mega 6.0軟件利用NJ(Neighbor-Jioning)法構建水牛TRAIL基因與其他物種的系統進化樹，結果見圖3。由圖3可知，與水牛親緣關系最近的是牦牛和普通牛，其次是山羊和綿羊，再次是野豬、馬、人和黑猩猩，與家鼠的親緣關系最遠。通過氨基酸序列比對發現，水牛TRAIL蛋白氨基酸序列與牦牛、普通牛相似性極高，在不同物種間其跨膜結構域和TNF結構域序列保守性較高(圖4)。推測TRAIL蛋白功能區在不同物種間比較保守。

圖1 水牛TRAIL基因PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification result of TRAIL gene in buffalo

圖2 水牛TRAIL基因核苷酸序列相似性比對Fig.2 The similarity alignment of nucleotide sequences of TRAIL gene in buffalo

圖3 TRAIL基因系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of TRAIL gene

Bb，水牛；Bm，牦牛；Bt，普通牛；Ss，豬；Ch，山羊；Oa，綿羊；Ec，馬；Hs，人；Pp，黑猩猩；Mm，家鼠 Bb,Buffalo;Bm,Bos mutus;Bt, Bos taurus;Ss,Sus scrofa;Ch,Capra hircus;Oa,Ovis aries;Ec,Equus caballus;Hs,Homo sapiens;Pp,Pan paniscus;Mm,Mus musculus圖4 水牛TRAIL蛋白氨基酸序列相似性比對Fig.4 The similarity alignment of amino acid sequences of TRAIL protein in buffalo

2.3 生物信息學分析

2.3.1 理化性質和親/疏水性分析 TRAIL蛋白分子式為C1518H2339N395O435S13，分子質量約為33 ku，原子總數為4 700，半衰期為30 h，理論等電點為8.80，脂肪系數為77.77，表示TRAIL可能為堿性蛋白質。水牛TRAIL蛋白由20種常見氨基酸組成，其中亮氨酸(9.8%)含量最高，半胱氨酸(1.4%)、組氨酸(1.4%)、色氨酸(1.4%)含量最低；帶正電荷的氨基酸殘基(Arg和Lys)38個，帶負電荷的氨基酸殘基(Asp和Glu)33個(表2)。水牛TRAIL蛋白不穩定系數為48.36，不穩定系數>40，屬于不穩定蛋白。

表2 水牛TRAIL蛋白氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of TRAIL protein in buffalo

采用PortScale在線軟件分析TRAIL蛋白的親/疏水性，預測標準為Hphob./Kyte & Doolittle，結果顯示，TRAIL蛋白平均親水性指數為―0.475，屬于親水性蛋白，最高分值(疏水性最強)出現在第21位苯丙氨酸(2.789)，最低分值(親水性最強)出現在第207位賴氨酸(―2.856)(圖5)。

圖5 水牛TRAIL蛋白親/疏水性預測Fig.5 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of TRAIL protein in buffalo

2.3.2 跨膜結構和結構域分析 經TMHMM 2.0軟件預測，水牛TRAIL蛋白第15―37位氨基酸處存在1個跨膜結構，即水牛TRAIL蛋白第1―14位氨基酸處為胞外區、15―37位氨基酸處為跨膜區、38―287位氨基酸處為胞內區(圖6)。經SMART軟件預測，水牛TRAIL肽鏈的胞內區具有1個TNF結構域，位于第140―285位氨基酸處(E-value=6.48e-45，圖7)。

圖6 水牛TRAIL蛋白跨膜區預測Fig.6 Transmembrane domain prediction of TRAIL protein in buffalo

圖7 水牛TRAIL蛋白結構域預測Fig.7 Structural domain prediction of TRAIL protein in buffalo

2.3.3 磷酸化位點和糖基化位點分析 對TRAIL蛋白的氨基酸序列進行磷酸化位點預測，共發現29個磷酸化位點，包括8個蘇氨酸位點、18個絲氨酸位點、3個酪氨酸位點，閾值為0.5(圖8)。分別用NetNGlyc 1.0和NetOGlyc 4.0在線軟件預測TRAIL蛋白糖基化位點，結果顯示，水牛TRAIL蛋白不存在糖基化位點。

圖8 水牛TRAIL蛋白磷酸化位點預測Fig.8 Phosphorylation site prediction of TRAIL protein in buffalo

2.3.4 信號肽切割位點和亞細胞定位分析 信號肽預測結果顯示，水牛TRAIL蛋白在第32位氨基酸處C值最高(0.153)，在第16位氨基酸處Y值最高(0.211)，在第6位氨基酸處S值最高(0.551)，在1―15位氨基酸處S值平均值為0.418，說明水牛TRAIL蛋白不存在信號肽切割位點，推測其為非分泌蛋白(圖9)。亞細胞定位分析結果顯示，水牛TRAIL蛋白主要存在于內質網(55.6%)中，線粒體、高爾基體、細胞核和細胞質中各占11.1%，因此TRAIL蛋白位于細胞質中的可能性大于細胞核，可能性分別為88.9%和11.1%，可信度為70.6%，表明該蛋白存在于細胞質中的可能性較大。

2.3.5 二級結構和三級結構分析 使用GORIV軟件預測TRAIL蛋白的二級結構，結果顯示無規則卷曲(51.57%)占比最高，其次是延伸鏈(24.39%)，而α-螺旋(24.04%)占比最低(圖10)。使用SWISS-MODEL軟件同源建模，水牛TRAIL蛋白的三級結構預測模型見圖11，與模板1 dg6.1(人Apo2L/TRAIL分子)的結構相似性為75.53%，GMQE值和QMEANDisCo Global值分別為0.47和0.70，可信度較高。

圖9 水牛TRAIL蛋白信號肽切割位點預測Fig.9 Signal peptide cleavage site prediction of TRAIL protein in buffalo

①h，α-螺旋；e，延伸鏈；c，無規則卷曲。②線條從長到短分別為α-螺旋、延伸鏈、無規則卷曲 ①h,Alpha helix;e,Extended chain;c,Random coil.②The lines form long to short represent alpha helix,extended chain and random coil,respectively圖10 水牛TRAIL蛋白二級結構預測Fig.10 Secondary structure prediction of TRAIL protein in buffalo

圖11 水牛TRAIL蛋白三級結構預測Fig.11 Tertiary structure prediction of TRAIL protein in buffalo

3 討 論

目前，研究人員已對人[3-4]、蝙蝠[24]、長江江豚[25]、馬[26]等哺乳動物的TRAIL基因進行了報道，且不同物種TRAIL基因CDS區長度不同，人TRAIL基因編碼區為846 bp，編碼281個氨基酸；蝙蝠TRAIL基因編碼區為843 bp，編碼280個氨基酸；長江江豚TRAIL基因編碼區為864 bp，編碼287個氨基酸；馬TRAIL基因編碼區為870 bp，編碼289個氨基酸。本試驗成功從沼澤型水牛卵巢組織中克隆得到TRAIL基因CDS序列，目前這是通過分子克隆從水牛中得到的第1個TRAIL基因。水牛TRAIL基因編碼區長864 bp，編碼287個氨基酸。將水牛TRAIL基因與GenBank中其他9個物種的TRAIL基因進行相似性比對發現，其與牦牛、普通牛、山羊和綿羊的相似性達到95.9%以上，與野豬、馬、人和黑猩猩的相似性達到81.3%以上，與家鼠的相似性最低，為70.0%。系統進化樹結果發現，水牛TRAIL基因與牦牛、普通牛進化關系最近，其次是山羊和綿羊，與家鼠的親緣關系最遠，說明該基因在不同物種間保守性存在差異，但總體來說具有較高的保守性。

TRAIL蛋白分子式為C1518H2339N395O435S13，屬于堿性、親水性蛋白且性質不穩定。通過氨基酸序列比對和理化性質預測得知，TRAIL蛋白在物種間高度保守一致。通過GeneDoc軟件分析發現，水牛TRAIL蛋白與其他9個物種之間的相似性較高。表明在哺乳動物中TRAIL的氨基酸序列是比較保守的，且胞外區比胞內區和跨膜區更保守。與其他TRAIL一樣，水牛TRAIL蛋白具有典型的跨膜區和TNF結構域，具有N-端非保守區，而C-端在不同物種之間具有較高的保守性。磷酸化修飾是可逆的，參與細胞信號轉導等過程，水牛TRAIL蛋白含有29個磷酸化位點，推測磷酸化修飾可能與該蛋白的生理功能有關，后期針對TRAIL蛋白功能分析可以借助磷酸化位點的變化來分析其在調控顆粒細胞發育及凋亡中的作用。蛋白二級結構預測發現，無規則卷曲是水牛TRAIL蛋白最主要的結構形式，進一步證實了水牛TRAIL蛋白性質不穩定的結果，易于改變空間構象。人TRAIL蛋白的第230位半胱氨酸(Cys230)是TRAIL發揮功能所必需的，通過形成分子間二硫鍵誘導凋亡[27]，且Cys230的突變影響其生物活性和穩定性[28]。Gao等[29]對鱖魚TRAIL進行了類似試驗，結果顯示，與對照相比，過表達突變型SCTRAIL-C203S不能誘導HeLa細胞的凋亡。Kahraman等[30]研究表明，TRAIL可通過激活Akt信號通路誘導嚙齒動物胰腺β細胞的增殖。本試驗中，水牛TRAIL蛋白含有3個保守的半胱氨酸殘基(Cys55、Cys76、Cys236)，由于Cys236與人TRAIL中Cys230位于相同的位置，推測水牛TRAIL蛋白在介導細胞增殖與凋亡方面也發揮著重要作用。

水牛產業是廣西的優勢特色產業，作為一種乳肉兼用的大型經濟動物，水牛以抗病性好、適應性強、耐粗飼且奶質優良等優點成為了熱帶、亞熱帶氣候地區的潛在優勢發展畜種。隨著規模化養殖業的逐漸發展，對水牛繁殖率的要求越來越高。了解水牛卵泡發展規律及其影響因素有利于提高水牛繁殖能力，提高生產的經濟效益。顆粒細胞位于卵母細胞透明帶外側，與卵母細胞相連，不僅對卵母細胞的成熟有重要影響，而且對整個卵巢的功能也作用極大。顆粒細胞和卵母細胞間的密切關系體現在顆粒細胞的增殖、分化由卵母細胞指導，反過來顆粒細胞又會為卵母細胞的成熟提供重要的營養和信號，所以顆粒細胞的狀態對卵母細胞質量及胚胎發育潛能有很大的影響[31-32]。在一定條件下，它們可以直接或間接地引起卵泡閉鎖。卵巢顆粒細胞凋亡包含2條途徑：線粒體途徑和死亡受體途徑。死亡受體途徑是由死亡受體和配體結合引起的，如TRAIL及其受體、Fas及其配體FasL；線粒體途徑主要由Bcl-2家族相關蛋白介導[33]。Wada等[34]研究表明，TRAIL及其受體可能在閉鎖卵泡中誘導豬卵泡顆粒細胞的凋亡，且DcR1能夠抑制顆粒細胞的凋亡。Inoue等[35]研究證實，TRAIL在豬卵巢卵泡閉鎖期間可誘導顆粒細胞的凋亡。但是，關于TRAIL調控水牛卵巢顆粒細胞發育及凋亡的作用機制鮮見報道。因此，克隆水牛TRAIL基因CDS區序列，利用生物信息學分析其編碼蛋白，不僅有助于了解水牛TRAIL基因結構與功能，還可為深入探究TRAIL蛋白對水牛卵巢卵泡發育、顆粒細胞增殖及凋亡的影響奠定基礎。

4 結 論

本試驗成功克隆水牛TRAIL基因CDS區序列，大小為864 bp，編碼287個氨基酸，TRAIL蛋白分子質量約為33 ku。系統進化樹結果顯示，水牛與牦牛和普通牛的親緣關系最近。TRAIL蛋白存在1個跨膜結構域，140―285位氨基酸處是TNF區，含有29個磷酸化位點，不存在糖基化位點和信號肽，是親水性蛋白，主要存在于細胞質中，二級結構以無規則卷曲為主。