CRISPR/Cas9系統在寄生蟲基因組編輯中的應用研究進展

馬 靜，張艷艷，賈新月，馬 勛，王正榮，薄新文,

(1.石河子大學動物科技學院，石河子 832000；2.新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所，省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室，石河子 832000)

基因編輯技術是利用核酸內切酶作為“分子剪刀”，對DNA進行靶向切割產生DNA雙鏈斷裂(double strand breaks,DSB)，誘導體內細胞產生2種修復機制,即非同源末端重組修復(non-homologous end joining,NHEJ)和同源重組修復(homology directed repair,HDR)[1],從而實現基因靶向修飾。基因編輯因能高效率地進行定點基因組編輯，在基因研究、基因治療和遺傳改良等方面展現出了巨大的潛力。

目前，在基因編輯發展過程中，巨型核酸酶(meganucleases,MNs)、鋅指核酸酶(zinc finger endonucleases,ZFNs)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)及CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated nuclease 9)系統是最主要的4種編輯工具。MNs又叫大范圍核酸酶，其可識別的位點序列較長，但識別效率較低；ZFNs是人工設計的含有鋅指DNA結合結構域和核酸內切酶FokⅠ切割結構域的蛋白核酸內切酶，但核酸內切酶FokⅠ必須形成二聚體才能將雙鏈DNA剪開；與ZFNs類似，TALENs也是由2個結構域——轉錄激活因子樣效應物(TALEs)DNA結合結構域和核酸內切酶FokⅠ催化結構域融合而成的；由于ZFNs和TALENs的復雜性、難度大和成本高等原因，使得它們的使用受到了限制[2]。作為獲得2020年諾貝爾化學獎的基因編輯技術，CRISPR/Cas9系統具有操作簡單、成本低、修飾效率高等優點[3]，成為了一種廣受歡迎的基因組靶向修飾技術，已成功應用于小鼠[4]、秀麗隱桿線蟲[5-6]、斑馬魚[7]、果蠅[8]、擬南芥[9]、水稻[10]、釀酒酵母[11]等模式生物。

鑒于此，研究人員開始將CRISPR/Cas9系統應用于寄生蟲基因組編輯，通過研究與蟲體發育、毒力及與宿主相互作用等相關基因，從而達到開發新的藥物靶點和疫苗的目的，現已成功運用于多種寄生蟲的基因組編輯。CRISPR/Cas9系統的應用發展迅速，筆者就該系統在寄生蟲基因組編輯中的研究進展進行綜述，旨在為后續相關研究提供參考依據。

1 CRISPR/Cas系統的發現與分類

1.1 CRISPR/Cas系統的發現

1987年,Ishino等[12]在對磷酸鹽代謝相關基因進行分析時，在大腸桿菌基因組中首次發現了一個不尋常的重復DNA序列，即一個29個核苷酸重復序列，但它們被不相關的、非重復的短間隔序列打斷。隨后在其他微生物中又有一些類似序列的報道，2000年,Mojica等[13]發現在所有原核生物中均有類似序列，直到2002年Jansen等[14]將此序列正式命名為“CRISPR”。為探究這些序列的起源，2005年,Mojica等[15]對67株細菌和古菌株的4 500條CRISPR序列進行測序后發現，CRISPR/Cas序列中的間隔序列來自外源的噬菌體、質粒等，同年Pourcel等[16]報道了鼠疫耶爾森菌中的CRISPR通過優先攝取噬菌體DNA獲得了新的重復序列。2007年,Barrangou等[17]首次證實了CRISPR/Cas是一種細菌適應性免疫系統。作為一種適應性免疫系統，CRISPR/Cas系統如何進行自我與非自我識別，如何抵抗外來入侵核酸呢？Deveau等[18]通過對噬菌體基因組原間隔序列的分析發現了一個與原間隔序列直接相鄰的短基序，稱為原間隔子相鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)，這種PAM基序對宿主進行自我與非自我識別非常重要[19]。Brouns等[20]研究發現，成熟的crRNA(CRISPR RNA)可作為小的引導RNA使Cas蛋白復合物能干擾病毒的增殖。2008年,Marraffini等[21]研究發現，CRISPR通過靶向DNA限制了葡萄球菌的水平基因轉移，且可限制抗生素耐藥性在致病細菌中的傳播。2010年,Garneau等[22]發現，嗜熱鏈球菌CRISPR1/Cas系統可特異性地切割質粒和噬菌體雙鏈DNA。2011年,Sapranauskas等[23]研究表明，嗜熱鏈球菌CRISPR3/Cas系統可轉移到大腸桿菌中并提供異種保護，防止質粒轉化和噬菌體感染。CRISPR/Cas系統不僅可特異性地切割，還可跨屬轉移，并對侵入性核酸提供異源干擾。由此可見，CRISPR/Cas系統的應用潛力有待進一步挖掘和研究。

2011年,Deltcheva等[24]發現，tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)介導crRNA的成熟對Cas9蛋白活性至關重要。2012年,Jinek等[25]在crRNA與tracrRNA形成雙鏈結構的基礎上通過將 crRNA的3′-端與tracrRNA的5′-端融合而生成嵌合RNA，即形成一個單鏈的向導RNA(single-guide RNA，sgRNA)后成功在體外引導Cas9切割質粒，由此CRISPR技術開始轉變為基因編輯工具。2013年,Cong等[26]利用CRISPR/Cas系統成功編輯哺乳動物基因組。

1.2 CRISPR/Cas系統的分類

CRISPR/Cas基因座編碼古細菌和細菌的適應性免疫系統，由于其快速進化及研究逐漸深入，使得CRISPR/Cas系統的分類復雜化。基于2011和2015年的分類，Makarova等[27]在2020年又更新進化了CRISPR/Cas系統的分類。目前，CRISPR/Cas系統被分為2個類、6種類型、17個亞型。第1類(Class 1)包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ 3種類型；第2類(Class 2)包括Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ 3種類型，而每種類型又被分為多種亞型。

CRISPR介導的適應性免疫包括3個步驟：適應、表達和干擾[22]。在適應步驟中，來自入侵元素的外源DNA片段(稱為原間隔子)被處理并作為新的間隔子合并到CRISPR陣列中[28]；在Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ型系統中此步驟由Cas1、Cas2、Cas4等基因編碼的關鍵酶負責，在Ⅳ、Ⅵ型系統中是Cas1、Cas2，而Ⅲ型系統在Cas1、Cas2的基礎上多了1個逆轉錄酶[27]。表達步驟包括CRISPR陣列的轉錄，然后將pre-crRNA(pre-CRISPR RNA)加工成成熟的crRNA，這些crRNA與1個或多個Cas蛋白組裝成CRISPR核糖核蛋白(crRNP)復合物[28]；在大多數第1類系統中，Cas6是直接負責加工的酶，在Ⅱ型系統中，加工是由細菌RNaseⅢ(一種非Cas蛋白)催化的，而在許多Ⅴ型和所有的Ⅵ型系統中，大型效應Cas蛋白包含一個獨特的催化中心負責加工[27]。干擾步驟包括crRNP復合物中的Cas核酸酶通過crRNA直接切割入侵的同源病毒或質粒核酸[28-29]；在第1類系統中，此步驟由多個Cas蛋白共同完成，即Cas3、Cas5、Cas8、Cas10和Cas11的不同組合，取決于類型和亞型。相比之下，在第2類系統中，此步驟由1個單一的大蛋白質——Cas9、Cas12或Cas13完成[27]。

2 CRISPR/Cas9系統在寄生蟲基因組編輯中的應用

寄生蟲作為一類具有致病性的低等真核生物，既可作為病原體，又可作為媒介傳播其他疾病。當前寄生蟲病的危害仍是普遍存在的公共衛生問題，寄生蟲病對人類和動物健康都構成了嚴重威脅。通過基因組序列信息及其功能了解寄生蟲與其宿主之間的關系，有助于開發新的診斷方法，也有助于開發新的藥物和疫苗等。CRISPR/Cas9基因編輯技術為研究寄生蟲基因功能提供了重要技術手段，該技術已成功運用于瘧原蟲(Plasmodium)、弓形蟲(Toxoplasma)、隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)、柔嫩艾美耳球蟲(Emeriatenella)、利什曼原蟲(Leishmania)、錐蟲(Trypanosoma)、陰道毛滴蟲(Trichomonasvaginalis)、犬新孢子蟲(Neosporacaninum)、巴貝斯蟲(Babesia)、血吸蟲(Schistosoma)、蜱蟲(tick)、蚊(mosquito)等。

2.1 瘧原蟲

2.1.1 惡性瘧原蟲 瘧原蟲屬是通過蚊子傳播的寄生蟲，是引起瘧疾的病原體。在5種人類感染的瘧疾寄生蟲中，惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)是毒力最強、最致命的寄生蟲，是造成高死亡率和發病率的主要病原。瘧原蟲屬缺乏非同源末端重組所必需的機制[30]，因此，需使用同源模板來實現同源定向修復。Ghorbal等[31]使用CRISPR/Cas9技術產生了同時攜帶pL7-orc1和pUF1Cas9的寄生蟲，全基因組測序證實了在內源性位點上存在所需的突變，即用丙氨酸替代Orc1亮氨酸137的突變，這種突變已被證實可影響1個編碼惡性瘧原蟲主要毒力因子基因的表達。CRISPR/Cas9系統在惡性瘧原蟲上的首次成功應用證明了有效的基因編輯對于研究瘧疾的巨大價值。

Wagner等[32]創建了應用T7啟動子而非U6啟動子驅動的雙載體系統，還證實了sgRNA-T可在體外指導DNA模板的特異性切割，其構建的第1個質粒pT7 RNAP-HR可表達T7-RNA聚合酶，并遞送DNA供體序列用于DSB修復；第2個質粒pCas9-sgRNA-T可表達Cas9和sgRNA到目標靶位點。隨著該系統的應用，Wagner等[32]報道了轉染后33 d編碼天然球形相關富組氨酸蛋白的kharp基因缺失，且刪除負責編碼紅細胞結合抗原175的eba-175基因后編輯效率在50%～100%之間。

雖然已在惡性瘧原蟲中開發了幾種基于CRISPR/Cas9系統的方法，但仍存在脫靶突變和攜帶供體模板DNA的環狀質粒與靶位點之間的意外重組。為此，Nishi等[33]對CRISPR/Cas9系統進行了改進，生成了內源性表達Cas9的寄生蟲，通過轉染僅含有線性DNA供體模板和sgRNA的質粒來改造基因，最終在既無脫靶突變也無意外重組的情況下，在2周內以>85%的高效率實現了定點誘變和熒光蛋白的融合。這種改進方式解決了惡性瘧原蟲CRISPR/Cas9系統目前的技術問題，將該系統在惡性瘧原蟲上的應用引入了一個新階段。此外，Zhao等[34]還開發了一種生成Cas9i系統的整合策略，顯著縮短了轉基因惡性瘧原蟲的生成時間，且通過惡性瘧原蟲的單輪轉染成功地實現了多重基因組編輯(突變或標記)。

2.1.2 約氏瘧原蟲 為建立Cas9蛋白在嚙齒動物瘧疾寄生蟲——約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii)中的內源性和組成性表達，Qian等[35]使用CRISPR/Cas9介導的基因組編輯方法將內源性基因sera1的編碼區替換為完整的化膿性鏈球菌Cas9(SpyCas9)編碼序列，成功產生了敲入Cas9的約氏瘧原蟲(PyCas9ki),得到的PyCas9ki蟲體在整個生命周期中發育正常，并在環狀體、滋養體和裂殖體階段具有Cas9蛋白的表達。上述研究通過引入僅含有sgRNA和同源模板元件的質粒(pYCs)，成功地實現了PyCas9ki寄生蟲基因組中不同內源性基因的缺失和標記修飾，且該PyCas9ki寄生蟲為約氏瘧原蟲的基因功能研究提供了一個新的平臺。

鑒于目前的研究方法可能受到可選擇標記物的可用性和產生轉基因寄生蟲所需時間的限制，且隨著外源序列的引入，還存在破壞天然基因調控元件的風險。Walker等[36]開發了一種基于化膿性鏈球菌Cas9，利用核酶-向導-核酶(ribozyme-guide-ribozyme，RGR)sgRNA表達策略和RNA聚合酶Ⅱ啟動子的瘧原蟲基因編輯系統CRISPR-RGR。通過將該系統應用于約氏瘧原蟲，成功破環了編碼PyALBA4 RNA結合蛋白的基因，并在pyalba4基因上插入了GFP標簽。

Xu等[37]開發了一種基于微同源性介導的末端連接(microhomology-mediated end joining，MMEJ)的CRISPR/Cas9(mCRISPR)策略，可有效地在具有重復序列的基因中同時產生多個突變寄生蟲，并為研究蟲體發育功能基因和疫苗研發提供了幫助。其在不使用模板DNA的情況下成功地在約氏瘧原蟲環子孢子表面蛋白(circumsporozoite surface protein，CSP)的中心重復區(central repeat region，CRR)產生了各種大小的突變體。突變后的寄生蟲在蚊子體內階段的發育存在嚴重缺陷，而在小鼠中與野生型約氏瘧原蟲17XL寄生蟲相似，表明CSP-CRR在蚊子階段的發育中發揮了重要作用。

2.2 弓形蟲

在許多人獸共患寄生蟲病中，弓形蟲病是最重要的疾病之一，是由一種專性的細胞內寄生的剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的，能感染包括人類在內的所有溫血動物。操縱弓形蟲基因組的能力可有助于發展有效的疫苗接種策略和更好的治療方法。盡管有有效的反向遺傳學系統，但同源整合并不是將外源DNA插入弓形蟲基因組的首選機制。相反，DNA通過非同源端連接隨機插入基因組。通過敲除關鍵成分KU80來失活非同源連接通路已被用于提高同源重組效率，從而促進弓形蟲的基因敲除和標記內源性位點[38-39]。

Sidik等[40]使用RNA引導的Cas9內切酶在不需要選擇的情況下有效產生敲除，并將點突變和表位標簽引入弓形蟲基因組，但由于缺乏可進行雙鏈斷裂修復的非同源連接機制，ΔKU80突變體比野生型弓形蟲更易受到遺傳的影響。進一步利用CRISPR/Cas9系統進行了剛地弓形蟲全基因組基因評估，分析每個基因在人類成纖維細胞感染中的作用，并確定了一種稱為類頂端復合體微粒蛋白(claudin-like apicomplexan microneme protein，CLAMP)的入侵因子[41]。

Shen等[42]使用CRISPR/Cas9來破壞Ⅰ型RH蟲體的尿嘧啶磷酸核糖轉移酶(UPRT)基因，UPRT基因的丟失導致蟲體對氟尿嘧啶脫氧核苷(FUDR)的耐藥性，電穿孔48 h后對Ⅰ型RH蟲株進行FUDR篩選和測序，成功產生了UPRT基因突變。此外，Shen等[42]還破壞了Ⅰ型GT1蟲體的ROP18位點，并補充UPRT位點的缺失，發現ROP18基因是影響急性毒力的一個重要因素。

Zheng等[43]利用CRISPR/Cas9系統進行基因敲除來評價弓形蟲亮氨酸氨基肽酶作為藥物靶點的潛力，通過表型分析發現，敲除弓形蟲亮氨酸氨基肽酶可抑制弓形蟲入侵和復制；通過補充弓形蟲亮氨酸氨基肽酶的同義替代等位基因，恢復了敲除寄生蟲的生長和入侵能力；小鼠試驗表明，敲除亮氨酸氨基肽酶在一定程度上降低了剛地弓形蟲的致病性，但由于沒有完全阻斷寄生蟲的發育、毒力或酶活性，其只能作為剛地弓形蟲的輔助藥物靶點使用。陳凱等[44]利用CRISPR/Cas9技術構建了弓形蟲Ⅰ型RH蟲株的MORN2基因敲除株,經體外噬斑試驗和體內感染試驗結果表明，MORN2基因的缺失幾乎不影響RH蟲株在體外培養時的生長速度和感染小鼠的毒力，證明MORN2基因在RH蟲株中無表型功能。Zhang等[45]利用CRISPR-Cas9技術檢測了CTrp26和CTrx1在Ⅰ型RH弓形蟲中的基本生物學功能,結果表明，CTrp26和CTrx1均位于弓形蟲速殖子的細胞質中，缺失這2種硫氧還蛋白(thioredoxins，Trxs)中的任何一種均不影響該寄生蟲的細胞內復制、逸出過程、斑塊形成、過氧化氫抗性、活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)，且這2種Trxs在昆明小鼠中不作為RH弓形蟲的毒力因子。

Chen等[46]對RH弓形蟲進行了全基因組CRISPR/Cas9功能缺失篩選，鑒定出了幾個新基因，選擇其中5個基因(HP1～HP5基因)進行進一步功能鑒定結果顯示，在RH弓形蟲中，HP1基因的靶向缺失導致了對過氧化氫的顯著敏感性，以及體外抗氧化能力、侵襲效率和增殖能力的下降；體內試驗結果也顯示，感染HP1-KO弓形蟲的小鼠存活時間比感染野生型弓形蟲的明顯延長。由此表明HP1基因可能與弓形蟲抗氧化損傷和毒性有關。

2.3 隱孢子蟲

隱孢子蟲是繼輪狀病毒后引起腹瀉的重要病原體之一，該寄生蟲約有3 950個基因，但由于其不能在體外長期培養，且缺乏有效的基因工具，目前還沒有針對該寄生蟲的有效疫苗，且只有一種已批準的藥物[47-48]。

Vinayak等[47]建立了在人回盲腸癌細胞(human ileocecal adenocarcinoma cells，HCT-8)中培養隱孢子蟲子孢子的瞬時轉染，但子孢子在細胞中只進行一兩輪復制便會死亡，并在此基礎上將轉染后的子孢子直接注入免疫缺陷小鼠的腸道內，構建了小鼠感染模型，解決了隱孢子蟲不能在體外長期培養的難題。為了使轉基因蟲體能富集，其構建了Nluc報告基因和新霉素耐藥標記物(Neo)之間的融合翻譯，以集中觀察轉染蟲體的小亞群。此外，其利用CRISPR/Cas9技術進行了DNA修復試驗，發現當隱孢子蟲與特定sgRNA共轉染時熒光素酶活性恢復；而沒有特定sgRNA時沒有觀察到這一變化。表明隱孢子蟲缺乏非同源重組修復，需同源重組修復。

2.4 柔嫩艾美耳球蟲

柔嫩艾美耳球蟲是腸道疾病球蟲病的病原體，是一種尖端復合體原生動物寄生蟲，在家禽寄生蟲疾病中尤為重要。基因組測序結果顯示，柔嫩艾美耳球蟲的生命周期由超過8 000個基因控制，這些基因控制著無性復制、兩性分化、傳播和毒性等高度協調的生命周期[49]。然而，由于缺乏系統分析基因功能的工具，大多數基因的功能仍不清楚。

Hu等[50]報道了CRISPR/Cas9基因編輯技術首次在柔嫩艾美耳球蟲中應用于單基因水平的基因功能分析及對整個基因家族的系統功能分析，其利用一個構成型表達Cas9的轉基因株系，證明了非同源端連接和引導同源重組介導的功能喪失。將該方法應用于EtGRA9基因定位的研究，發現該基因編碼一種分泌蛋白，可能幫助子孢子釋放，并可能在子孢子和裂殖子的入侵過程中發揮重要作用。利用該方法對ApiAp2轉錄因子基因家族進行系統破壞，發現該寄生蟲表達的33個因子中有23個對蟲體的發育和生存至關重要。這些發現將為未來對柔嫩艾美耳球蟲發病機制和蟲體發育相關基因功能研究奠定基礎。Tang等[51]使用CRISPR/Cas9對柔嫩艾美耳球蟲的子孢子進行編輯，成功地標記了內源性微素蛋白2(EtMic2)，證明了CRISPR/Cas9系統能有效地介導HDR的靶基因斷裂和修復及柔嫩艾美耳球蟲的內源性基因修飾。

2.5 利什曼原蟲

杜氏利什曼原蟲(Leishmaniadonovani)是致命的內臟利什曼病的病原體。為了解利什曼原蟲的感染和發病機制，并確定控制利什曼病的新藥物靶點，需更有效的方法來操縱這種寄生蟲基因組。Zhang等[52]利用錘頭型核酶和丁型肝炎病毒(HDV)核酶開發了一種提高基因靶向效率的雙sgRNA表達載體，精確缺失了大小為3 kb的米替福新轉運基因(LdMT)。此外還發現了CRISPR/Cas9在LdMT基因中引起的一個新的單點突變，導致LdMT的單一氨基酸從蛋氨酸變為蘇氨酸(M381T)。該突變導致了對米替福新(miltefosine，MLF)的耐藥性，這是唯一可用的口服抗利什曼原蟲藥物MLF的憂患所在。通過將博萊霉素耐藥基因表達盒插入Cas9切割位點，成功敲除了非必需基因Ldbpk_241510.1(一個多藥耐藥蛋白樣基因)，并使用相同的方法成功用GFP標記了LdMT蛋白的N-端部分(381個氨基酸)，表明CRISPR/Cas9系統可以破壞并精確標記內源性基因。

A2是一個多拷貝基因家族，是內臟利什曼原蟲感染的重要毒力因子[53]。在杜氏利什曼原蟲1SCL2D中至少有11個大小不同的A2基因拷貝[54]。Zhang等[55]通過靶向杜氏利什曼原蟲LdMT和A2基因，對CRISPR/Cas9活性進行共同選擇來提高A2基因缺失的效率，通過免疫印跡分析，該系統可完全刪除A2基因，且CRISPR/Cas9共同靶向A2與LdMT基因顯著減少了刪除A2基因所需的時間。

在利什曼原蟲前鞭毛體的表面，磷酸糖(PG)，如脂磷酸糖(LPG)、蛋白磷酸糖(PPG)、游離磷酸糖聚合物(PGs)和酸性磷酸酶(sAP)等，通過調節巨噬細胞信號和細胞內運輸，促進利什曼原蟲在宿主細胞內的入侵和生存[56]。磷酸糖的合成依賴于LPG2基因編碼的高爾基GDP-甘露糖轉運體，Jesus-Santos等[57]使用CRISPR/Cas9系統敲除利什曼原蟲LPG2基因，將成功敲除LPG2基因的寄生蟲感染人類中性粒細胞并共孵育3 h，與野生型寄生蟲感染相比，中性粒細胞內寄生蟲的負荷量降低了83%，表明LPG2基因的缺失會減少蟲體對人類中性粒細胞的感染。

2.6 錐蟲

克氏錐蟲(Trypanosomacruzi)是恰加斯病的病原體，是一種能同時感染人類和其他動物的原生動物寄生蟲。克氏錐蟲是最不被了解的原生動物之一，是導致感染性心臟病的原因。克氏錐蟲的遺傳復雜性及有限的基因組工程技術導致了對該病原體的認識和研究相對缺乏[58-59]。

然而，Peng等[60]的發現改變了這種情況，其將CRISPR/Cas9系統應用于克氏錐蟲的基因工程，快速有效地敲除了包括必需基因在內的多個內源性基因。同時還觀察到，在沒有模板的情況下，克氏錐蟲中Cas9誘導的DSB的修復是通過不同大小缺失的微同源性介導的末端連接(MMEJ)引起的。當提供DNA修復模板時，CRISPR/Cas9可極大地促進所提供的模板和基因組中特定位置之間的同源重組，其效率比沒有CRISPR/Cas9誘導的DSB高幾個數量級。此外，Peng等[60]通過敲除1個由65個成員組成的酶基因家族(β-半乳糖呋喃糖基糖基轉移酶家族)，導致在沒有明顯脫靶突變的情況下酶產物顯著減少，證明CRISPR/Cas9具有顯著的多路復用能力，同時發現Cas9可介導其自身編碼序列的破壞，挽救穩定表達Cas9的寄生蟲的生長缺陷。

CRISPR介導的編輯，除了將Cas9和sgRNA質粒轉染進入生物體內，使其內源性表達發生編輯作用外，還可通過在體外生成Cas9/sgRNA核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)復合物來實現。Soares等[61]將純化的重組金黃色葡萄球菌Cas9蛋白(SaCas9)和體外轉錄單引導RNA(sgRNAs)在體外進行組裝后，經電穿孔導入克氏錐蟲的不同生命周期階段內，對報告基因和內源性基因進行了高效的基因組編輯，首次將Cas9-sgRNA RNP復合物遞送到克氏錐蟲的上鞭毛體和錐鞭毛體內進行基因編輯，從而提供了一種簡單、快速、無克隆和選擇的方法來評估這些重要病原體的基因功能。

Lander等[62]使用CRISPR/Cas9系統以枯草芽孢桿菌的glmS基因編碼的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰胺轉移酶內源性標記克氏錐蟲糖蛋白72(T.cruziglycoprotein 72，TcGP72)和液泡內質子焦磷酸酶(T.cruzivacuolar proton pyrophosphatase，TcVP1)。通過PCR和蛋白印跡分析證實了使用glmS核酶沉默內源性基因的表達。同時還發現在正常生長條件下，克氏錐蟲能產生足夠水平的內源性6-磷酸氨基葡萄糖(GlcN6P)來刺激glmS核酶活性，而不需要向培養基中添加葡萄糖胺。該研究為驗證克氏錐蟲潛在藥物靶點提供了一種可行的方法。

2.7 陰道毛滴蟲

性傳播的陰道毛滴蟲在全球范圍內流行，但其發病機制尚不清楚。由于其復雜、重復的基因組和缺乏有效方法，使其遺傳操作受到了阻礙。Janssen等[63]首次將CRISPR/Cas9系統應用于陰道毛滴蟲，利用同源定向修復證明了Cas9-gRNA可定向修飾一個納米熒光素酶報告基因，并成功敲除了陰道毛滴蟲的2個內源性基因，即編碼鐵氧還蛋白1(ferredoxin-1,Fd-1)的fd-1基因和編碼人類巨噬細胞遷移抑制因子(migration inhibitory factor，MIF)同源物的mif基因。

陰道毛滴蟲通過附著在黏膜上皮細胞上定植于人類的泌尿生殖道，從而造成感染。Molgora等[64]報道了陰道毛滴蟲一種表面蛋白——TVAG_157210(TvAD1)的鑒定，并描述了其在陰道毛滴蟲黏附宿主中的作用，這是首次關于陰道毛滴蟲表面蛋白與宿主糖胺聚糖相互作用以啟動寄生蟲黏附于宿主的報道。TvAD1通過與宿主糖胺聚糖(GAGs)中硫酸肝素(HS)的組成部分N-乙酰氨基葡萄糖結合而與宿主表面相互作用，利用CRISPR-Cas9系統產生了敲除(KO)TvAD1的寄生蟲，結果發現，與野生型相比，TvAD1-KO寄生蟲對宿主細胞的黏附性顯著減少。通過在TvAD1-KO寄生蟲中過表達TvAD1使表型恢復后，與TvAD1-KO寄生蟲相比，其黏附性明顯恢復。表明TvAD1在陰道毛滴蟲黏附于宿主細胞中發揮重要作用。

2.8 犬新孢子蟲

犬新孢子蟲是一種專性細胞內寄生的原生動物病原體，與剛地弓形蟲相似，但不感染人類[65-66]，其可寄生于宿主的所有有核細胞中，在入侵宿主后，犬新孢子蟲的速殖子居住在一個特殊的膜性細胞器中，稱為寄生液泡(parasitophorous vacuole，PV)。PV具有抵抗宿主細胞酸化和溶酶體酶水解的功能，從而防止宿主細胞清除外源性寄生蟲。此外，液泡內網絡(intravacuolar network，IVN)增強了寄生蟲對宿主胞質內物質的攝取[67]。

Arranz-Solís等[68]首次利用CRISPR/Cas9系統對犬新孢子蟲進行基因組編輯，成功敲除了Nc-1蟲體中表達綠色熒光蛋白的gfp基因，并通過插入耐乙胺嘧啶盒有效破壞了分離型Nc-Spain7蟲體中的NcGRA7基因。該技術在犬新孢子蟲中的成功應用為該寄生蟲的高效基因靶向修飾奠定了基礎。

Yang等[69]利用CRISPR/Cas9基因組編輯系統鑒定了一種新型的致密顆粒蛋白——犬新孢子蟲顆粒蛋白17(NcGRA17)，生成了NcGRA17基因敲除蟲體(ΔNcGRA17)和NcGRA17基因互補蟲體(iΔNcGRA17)。試驗結果發現，ΔNcGRA17形成的斑塊較小，細胞內生長較慢，對小鼠的毒力喪失。此外，還觀察到NcGRA17缺陷寄生蟲的PV具有異常的形態，結果表明，NcGRA17作為一種致密的顆粒蛋白決定了PV的形態和致病性，而NcGRA17的α-螺旋可能是導致PV形態異常的原因。

Wang等[70]利用CRISPR/Cas9基因組編輯系統獲得了犬新孢子蟲Nc-1的NcGRA7敲除蟲體(ΔNcGRA7)和NcGRA7互補蟲體(iΔNcGRA7)，并通過一系列試驗研究其在小鼠先天免疫中的作用，結果表明，NcGRA7在調節小鼠免疫因子和免疫相關鳥苷三磷酸酶a6(immunity-related guanosine triphosphatase a6，IRGa6)在寄生液泡膜(parasitophorous vacuole membranes,PVM)上的聚集中起著重要作用，從而影響了犬新孢子蟲的致病性。Zhao等[71]成功構建了ΔNcGRA6蟲體，并驗證了NcGRA6是一個關鍵的毒力因子，NcGRA6基因的破壞可減緩犬新孢子蟲的增殖，降低其對宿主的致病性。Dong等[72]構建了ΔNcGRA2蟲體，表明NcGRA2作為一種致密的顆粒蛋白，形成了PV的液泡內網絡結構，通過減緩增殖來削弱犬新孢子蟲的毒力。Yang等[73]構建了NcGRA23和NcGRA11(a-e)敲除寄生蟲，經研究表明，NcGRA23或NcGRA11(a-e)的缺失并不影響犬新孢子蟲的繁殖和毒力。

為了在犬新孢子蟲中實現高效的同源重組，Mineo等[74]針對基因組參考蟲體Nc-Liverpool (NcLiv)的Ku異源二聚體DNA修復機制，破壞了NHEJ酶Ku80，結果表明Ku80的缺失會導致其二聚體Ku70的不穩定和丟失，但能獲得高效的基于CRISPR/Cas9的基因標記和敲除。通過選擇3個基因(剛地弓形蟲分泌蛋白GRA48的犬新孢子蟲同源蛋白(NcGRA48,NCLIV_069360)、一種新的犬新孢子蟲特異性蛋白NCLIV_066730和一種新的蛋白 NCLIV_049870)進行表位標記來比較CRISPR/Cas9介導的內源性基因的表位標記的效率。結果表明，Δku80寄生蟲的標記效率從Ku80存在時的20%左右提高到95%，并將第一個被鑒定出來的特異性蛋白NCLIV_066730命名為犬新孢子蟲特異性GRA蛋白1(NSG1)，而NCLIV_049870蛋白定位于寄生蟲的細胞核。

2.9 巴貝斯蟲

巴貝斯蟲是一種只在紅細胞中入侵和繁殖的蜱傳寄生蟲，對畜牧業、寵物動物和野生動物的健康有巨大的經濟影響，可感染多種哺乳動物，被認為是僅次于錐蟲的第二常見血液寄生蟲。對藥物和殺螨劑的耐藥性以及缺乏有效的疫苗是控制巴貝斯蟲病的主要障礙[75]。

Hakimi等[76]首次將CRISPR/Cas9系統應用于巴貝斯蟲，成功進行了表位標記、點突變和缺失。SBP3在寄生蟲感染的紅細胞的細胞質中表達，并表現出特有的染色模式。利用CRISPR/Cas9系統在sbp3基因開放閱讀框(ORF)的3′-端插入一個編碼2-myc標簽表位的序列，經PCR和IFAT檢測，結果表明成功標記了sbp3基因。Tpx-1是一種細胞質抗氧化酶過氧化物還蛋白，在其催化位點上具有過氧化物Cys，可減少過氧化物底物[77-79]。Hakimi等[76]利用CRISPR/Cas9系統對tpx-1基因進行點突變，將過氧化物Cys(Cys49)轉化為Ser，發現該突變對活性氮(RNS)敏感性的影響小于完全缺失Tpx-1 ORF的影響。表明除了過氧化物Cys外，還存在其他催化位點，可以與RNS反應和解毒。

2.10 血吸蟲

曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni)是寄生在人體的血吸蟲之一。就發病率和死亡率而言，血吸蟲病被認為是人類蠕蟲病中最致命的一種。血吸蟲卵在疾病的發病、致病和傳播中起著核心作用[80]。

Ittiprasert等[81]首次利用CRISPR/Cas9基因編輯技術靶向曼氏血吸蟲的omega-1 (ω1)基因，成功產生了ω1轉錄本和核糖核酸酶的缺失，該基因編碼的ω1核糖核酸酶對Th2極化和肉芽腫的形成至關重要。在巨噬細胞/T細胞共培養中，基因編輯的蟲卵不能極化Th2細胞因子反應。尾靜脈注射小鼠后，ω1突變蟲卵周圍的肺肉芽腫體積明顯減少。該研究不僅在mRNA和蛋白水平上誘導了可檢測到的敲除，還觀察到了明確的表型變化，由此證明了基因編輯在血吸蟲功能基因組學中的應用價值。

Sankaranarayanan等[82]使用CRISPR/Cas9在曼氏血吸蟲中引入了第2個基因突變，即SULT-OR的體細胞突變。SULT-OR是曼氏血吸蟲在寄生階段表達的一種磺基轉移酶，其突變導致了曼氏血吸蟲對藥物奧沙尼喹的耐藥性。進一步比較了該方法在寄生蟲的蟲卵、母孢子囊和成蟲這3個不同發育階段的效率，結果顯示，經CRISPR/Cas9處理的成蟲中有0.3%～2.0%的序列顯示了跨越Cas9切割位點的缺失，而孢子囊缺失率為0.1%～0.2%，但在蟲卵中這種缺失極為罕見。在成蟲和孢子囊中最常見的缺失是預測切割位點上游34 bp的缺失，但也觀察到了長達3倍的罕見缺失，即從預測的Cas9切割位點延伸到上游102 bp。表明SULT-OR的編輯效率在成蟲中最高，其次是孢子囊，而在蟲卵中效率最低。

You等[83]報道了通過將CRISPR/Cas9與單鏈寡核苷酸(ssODNs)結合，電穿孔轉染試驗感染小鼠肝臟中提取的蟲卵，成功編輯了曼氏血吸蟲的乙酰膽堿酯酶(AChE)基因。目標區域下一代測序分析顯示，CRISPR/Cas9在蟲卵中誘導的主要修飾是通過同源定向修復產生的。此外，來自AChE編輯蟲卵的可溶性蟲卵抗原表現出明顯的AChE活性降低，表明程序化的Cas9裂解突變了AChE基因。將編輯后的血吸蟲卵注射到小鼠尾靜脈，與注射未突變蟲卵的對照組小鼠相比，注射基因編輯蟲卵的小鼠的肺細胞和脾細胞中檢測到涉及白細胞介素-4(IL-4)、IL-5、IL-10和IL-13的Th2型反應顯著增強。當基因編輯蟲卵注射到小鼠回腸漿膜下層時，蟲卵在小腸引流的腸系膜淋巴結細胞中誘導Th2型反應，IL-4、IL-13和GATA結合因子3(GATA-binding factor 3,GATA3)水平升高。這些發現證實了CRISPR/Cas9介導的基因編輯在血吸蟲功能基因組學中的潛力和實用性。

幼蟲在中間寄主——光滑雙臍螺(Biomphalariaglabrata)中的發育是曼氏血吸蟲生命周期的一個必要的組成部分。對宿主防御機制的了解可能會加速阻斷血吸蟲病傳播工具的發展。同種異體移植物炎癥因子1(allograft infammatory factor 1,AIF)是一種保守的鈣結合蛋白，通常在吞噬細胞和中性粒細胞中表達，是巨噬細胞活化的標志。Coelho等[84]電穿孔轉染光滑雙臍螺胚胎(Biomphalariaglabrataembryonic，Bge)細胞，成功產生了BgAIF基因的目標突變，且該突變通過非同源端連接修復。此外，與對照組細胞相比，基因編輯的Bge細胞與血吸蟲孢子囊的黏附明顯受阻，這為進一步研究宿主與血吸蟲相互作用中的其他成分奠定了基礎。

2.11 蜱蟲

蜱蟲是專性吸血的體外寄生蟲，是人類、野生動物和家畜多種病原體的重要載體。黑腿蜱(black-legged tick，Ixodesscapularis)，屬于硬蜱科(Ixodidae)，是一種自然疫源性疾病萊姆病的傳播媒介。僅僅在美國，每年就有超過4萬例萊姆病病例報告，而實際感染人數可能超過30萬例[85]。蜱蟲卵很特殊，其卵內高壓，還具有堅硬的絨毛膜；此外，雌性蜱蟲通過一種稱為吉氏器(Gene’s organ)的特殊器官在卵上涂上一層堅硬的蠟層，使卵相互黏結在一起。這一系列因素使得通過胚胎注射對蜱蟲進行基因編輯的技術難以實現。

Sharma等[86]首次成功在黑腿蜱中進行了CRISPR/Cas9基因編輯，其使用了2種方法對蜱蟲進行基因編輯：一種方法是直接進行胚胎注射CRISPR/Cas9基因編輯系統，注射后卵的存活率大約只有10%；另一種方法為ReMOT控制(receptor-mediated ovary transduction of cargo,ReMOT Control)，被稱為受體介導的卵巢轉導，其將Cas9 RNP復合物直接從血腔傳遞到發育中的節肢動物生殖系，允許通過成蟲注射而不是胚胎微注射產生靶向和遺傳突變。首先通過顯微手術切除雌性蜱蟲的吉氏器，從而使得蜱蟲產的卵不再被蠟層包裹，并用苯扎氯銨和氯化鈉處理卵，以去除絨毛膜并使卵干燥以降低卵內壓力，這樣就更易向其注射CRISPR/Cas9基因編輯系統，注射后卵的存活率高達100%。該研究將為蜱蟲生物學和蜱蟲-病原體-宿主的研究開辟新的途徑。

2.12 蚊

2.12.1 伊蚊 埃及伊蚊(Aedesaegypti)是基孔肯雅熱、黃熱病和登革熱病毒的有效傳播媒介，每年造成數億人感染和5萬多人死亡[87]。埃及伊蚊的基因突變已用TALENs、ZFNs和歸巢內切酶建立起來，這需要DNA結合蛋白結構域的工程來提供基因組靶標序列的特異性，而這些蛋白很難設計。Dong等[88]在一個同時表達紅色熒光蛋白(DsRed)和增強青色熒光蛋白(ECFP)的轉基因蚊子系中，針對ECFP核苷酸序列進行破壞，當提供Cas9酶和2種靶向ECFP基因不同區域的sgRNAs作為體外轉錄的mRNA用于種系轉化時，個體仍然表達DsRed，但不再表達ECFP。經PCR擴增、克隆和測序發現ECFP靶基因包含2～27個核苷酸。這些結果首次表明，CRISPR/Cas9介導的基因編輯可在埃及伊蚊中實現，為進一步研究該蚊種的功能基因組學提供了參考。為了產生穩定的生殖系突變，Kistler等[89]將CRISPR/Cas9試劑顯微注射到胚前期胚胎(細胞化前由細胞核合胞體組成的胚胎)，為體細胞和生殖系細胞的細胞核提供基因組編輯試劑。其進一步研究了顯微注射混合成分的編輯效率，證明了CRISPR/Cas9通過不同的修復機制產生不同類型突變的能力，并報告了幾個基因組位點的穩定的種系突變。

2.12.2 按蚊 在約450種按蚊中約有60種被認為是人類瘧疾的傳播媒介，是重要的寄生蟲病病原[90]。Dong等[91]建立了改良的瘧疾傳播媒介岡比亞按蚊(Anophelesgambiae) 的CRISPR/Cas9基因編輯程序，研究了纖維蛋白原相關蛋白1(FREP1)失活對蚊子對瘧原蟲的敏感性和對蚊子適應度的影響。FREP1基因敲除突變體發展成成蚊，在卵囊和子孢子階段顯示出對人類和嚙齒動物瘧疾寄生蟲感染的明顯抑制。然而，FREP1基因失活對蚊子適應度也產生了影響，包括顯著降低吸血傾向、繁殖力和卵孵化率，化蛹時間延遲及吸血后壽命縮短。基于CRISPR/Cas9基因操縱蚊子(特別是按蚊)的胚胎注射方法是困難和低效的，Macias等[92]采用ReMOT控制(受體介導的卵巢轉導)技術將Cas9核糖核蛋白復合物傳遞到成蚊卵巢，在不注射胚胎的情況下在瘧疾傳播媒介斯氏按蚊(Anophelesstephensi)中產生了靶向突變和可遺傳突變。在按蚊中，ReMOT控制的基因編輯效率與標準胚胎注射一樣高。ReMOT控制對按蚊的應用為缺乏胚胎注射設備或專業知識的瘧疾實驗室擴展了CRISPR/Cas9技術的應用，建立了針對不同種類蚊子的ReMOT控制的靈活性。

3 小 結

CRISPR/Cas9技術自2013年發展以來，已被應用于多種研究領域中，如通過基因的敲入與敲除、DNA單堿基突變對基因進行精準修飾，從而提高某些植物的產量與抗病性、構建動物疾病模型、治療疾病等。然而，CRISPR/Cas9系統在寄生蟲研究領域中仍有許多不足，主要有以下幾個方面：①當前較為成功的研究案例大多來自原蟲，且已在功能基因研究和疫苗研究方面取得進展，但其他多細胞寄生蟲的基因組編輯研究進展較為緩慢，僅有血吸蟲的研究報道，其原因可能是原蟲是單細胞，且大多可進行實驗室傳代，易于操作，而多細胞寄生蟲生活史復雜，在蟲體發育過程中很難找到易于進行基因編輯的單細胞期；②與原蟲基因編輯效率相比，多細胞寄生蟲編輯效率較低，其原因可能是多細胞寄生蟲發育周期復雜，不同發育階段蟲體組織結構變化大，不可控因素較多；③基因編輯的脫靶突變現象等問題。因此，需進一步優化技術方案，以盡快實現更多多細胞寄生蟲的基因組編輯，進而加快基因功能解析、藥物及疫苗研發的進程。

隨著CRISPR/Cas系統的不斷發展與改進，其可能在寄生蟲基因組規模的功能注釋中也發揮重要作用。在不久的將來，該技術可能被廣泛應用于寄生蟲轉錄組和蛋白質組的后續研究，可更好地理解基因組功能、表達和調控機制，為臨床檢測、早期診斷和疾病預防等方面的應用提供試驗基礎，從而有效防治寄生蟲病，促進人類健康。