果子貍源細小病毒分離鑒定及VP2基因遺傳進化分析

譚 斌，王 超，王 巖，張淑琴

(1.中國農業科學院特產研究所，長春 130122；2.黑龍江省農業科學院，哈爾濱 150086)

肉食獸細小病毒可感染貓科、犬科、浣熊科和鼬科等多種動物，導致患病動物出現以劇烈腹瀉和出血性腸炎為主要特征的疾病，死亡率達80%。肉食獸細小病毒病已成為對世界犬貓等寵物、經濟動物、野生動物及實驗動物等危害最為嚴重的傳染病之一[1-3]。肉食獸細小病毒依據感染宿主不同，主要包括貓泛白細胞減少癥病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)、水貂腸炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)、犬細小病毒(Canine parvovirus,CPV)等,他們同歸屬于細小病毒科(Parvoviridae)細小病毒亞科(Parvovirinae)的自主復制病毒。細小病毒為單股負鏈無囊膜的DNA病毒，其利用宿主細胞中的聚合酶在細胞核中復制[4-5]。自然變異株或在細胞上傳代的高代次病毒基因序列變異率和一些RNA病毒的變異率相當。自1978年CPV-2被鑒定后不久就發生抗原變異，2個新型抗原突變體出現CPV-2a和CPV-2b型，隨后，CPV-2a和CPV-2bVP2基因發生297位(S→A)的突變，產生了New CPV-2a和 New CPV-2b變異株；2000年，以426位(D→E)突變為特征的另一種新的抗原突變體CPV-2c被報道[6-8]。相對于最初的CPV-2，抗原突變體對犬的致病性更高，且病毒的宿主范圍不斷擴大[9-10]。

果子貍學名花面貍，屬于食肉目、靈貓科，是一種珍貴的經濟動物[11]。腹瀉是對果子貍養殖危害最為嚴重的疾病之一，群體發病多由細小病毒引起，給果子貍養殖業造成巨大經濟損失。本研究從患腸炎果子貍病料中分離到1株細小病毒，并比較了與其他肉食獸細小病毒流行株的VP2基因的遺傳變異情況，以期為細小病毒流行及抗原變異情況及防治提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

果子貍腸道組織樣品采集自山西省某果子貍養殖場。患病動物表現為拒食、脫水、腹瀉、血便等臨床癥狀。將病死動物的腸道組織用無血清 DMEM培養液(加入青霉素、鏈霉素濃度各為1 000 U/mL)制成 20%(V/V)懸液,凍融1次,以 5 000 r/min 離心10 min,吸取上清,用0.22 μm濾膜除菌,-80 ℃ 保存用于病毒分離。

1.2 主要試劑

貓腎細胞(CRFK細胞)由中國農業科學院特產研究所保存；FITC標記抗CPV熒光抗體購自VMRD公司；新生牛血清購自天津灝洋生物材料有限公司；細胞培養基MEM和胰酶均購自HyClone公司；DNA 提取試劑盒、Pfu聚合酶均購自北京全式金生物技術有限公司；DNA Marker和pMD18-T載體均購自TaRaKa公司。

1.3 病毒分離

CRFK細胞長滿單層后，用胰酶消化成單個細胞，以40%的細胞密度鋪入6孔細胞培養板，將制備的病毒樣品采用同步接毒方法接種于上述CRFK細胞，同時設正常細胞對照,然后放入37 ℃、5% CO2細胞培養箱中進行培養,每天觀察細胞狀態和病變情況，當細胞病變效應(CPE)達到80%時，反復凍融3次后收獲病毒于-80 ℃保存備用。

1.4 血凝試驗

參照《中華人民共和國獸用生物制品質量標準(2001)》[12]進行微量血凝試驗，分別用1%豬、雞、綿羊和人“O”型血紅細胞懸液測定第3代細胞培養物的血凝性，以50%以上紅細胞出現凝集判定為陽性。

1.5 免疫熒光試驗鑒定分離病毒

將收集的第3代病毒液同步接種于96 孔板內生長狀態良好的CRFK細胞，同時以不接毒的正常細胞作為陰性對照，37 ℃恒溫培養 60 h；棄去 96 孔板中的上清液，PBS 溫和洗滌 3 次，加入預冷的固定液(甲醇∶丙酮=1∶3)，4 ℃固定 30 min。棄去固定液，每孔加入 100 μL PBS 洗滌，洗滌 3次后，加入 FITC標記的抗CPV熒光抗體，每孔50 μL，37 ℃孵育 40 min，PBS 洗滌3次后，熒光顯微鏡下觀察結果。

1.6 病毒形態觀察

將收集到的第3代病毒液反復凍融3次后，以4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取上清液進行磷鎢酸負染，電鏡觀察。

1.7 病毒DNA提取與VP2基因克隆

按照病毒DNA快速提取試劑盒說明書提取病毒DNA，擴增VP2 基因。參照NCBI數據庫肉食獸細小病毒VP2 基因保守區設計擴增引物，引物序列為：VP2F：5′-CATGAGTGATGGAGCAGTTC-3′；VP2R：5′-CTATGTTAATATAATTTTCT-3′。引物由上海英駿生物有限公司合成。PCR反應體系50 μL:2×TransStart FastPfuFly PCR SuperMix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,模板2.0 μL，ddH2O補至50 μL。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收PCR產物連接到pMD18-T載體中，克隆產物送上海英濰捷基生物工程有限公司進行測序。

1.8 VP2基因遺傳進化分析

使用DNAStar軟件對分離毒株VP2基因序列與GenBank中檢索的不同基因型細小病毒VP2基因進行序列比對分析，并根據VP2基因中關鍵氨基酸位點對分離毒株進行基因型鑒定,應用Mega 7.0軟件構建系統發育樹。

2 結 果

2.1 病毒分離培養

病料樣品接種于生長狀態良好的CRFK細胞后，第4天出現CPE,呈現單個細胞圓縮、脫落，拉網等病變，而對照細胞生長狀態良好，未出現CPE(圖1)。隨著傳代次數的增加,CRFK細胞的病變更為明顯。

A，正常CRFK細胞;B，接毒后CRFK細胞。下同 A，Normal CRFK cells;B，Infected CRFK cells. The same as below圖1 分離株接種CRFK細胞后的CPE(100×)Fig.1 CPE of the isolated strain infected CRFK cells (100×)

2.2 血凝試驗

分別用豬、雞、綿羊、和人“O”型紅細胞測定分離毒株的第3代細胞培養物的血凝特性，結果顯示，該分離毒株僅對豬紅細胞發生凝集作用，其余紅細胞均不發生凝集，對豬紅細胞血凝效價為1∶512。

2.3 免疫熒光試驗鑒定病毒

將第3代病毒感染CRFK細胞60 h后，以FITC標記的抗CPV熒光抗體進行免疫熒光試驗,在倒置熒光顯微鏡下觀察。結果顯示,分離病毒感染的CRFK細胞內有特異性亮綠色熒光,對照CRFK細胞無熒光(圖2)。

圖2 免疫熒光試驗鑒定分離病毒(100×)Fig.2 Identification of the isolated strain by direct immunofluorescence assay (100×)

2.4 病毒形態電鏡觀察

在電鏡下觀察到無囊膜球形病毒粒子，大小約20 nm(圖3),與細小病毒粒子形態一致。

圖3 分離毒株電鏡形態學觀察結果(40 000×)Fig.3 Electron microscopic observation of the isolated strain (40 000×)

2.5 VP2基因克隆

應用VP2基因引物對第3代病毒的DNA進行擴增，得到大小約為1 750 bp的目的片段(圖4)，與預期片段大小相符，經過克隆后測序，確定為細小病毒基因序列，將此分離毒株命名為MPCPV-SX。

M，DL2000 DNA Marker;1,分離毒株VP2 基因擴增產物;2,陰性對照 M，DL2000 DNA Marker;1,VP2 gene of the isolated strain;2,Negative control圖4 分離毒株 VP2 基因PCR擴增電泳圖Fig.4 PCR amplification result of VP2 gene of the isolated strain

2.6 遺傳進化分析

將MPCPV-SX的VP2 基因序列上傳 GenBank，獲得的登錄號為KC262178。將VP2基因與數據庫中的20個不同基因型的細小病毒的VP2基因構建系統發育樹，發現該果子貍來源的細小病毒MPCPV-SX的VP2基因與犬細小病毒處于同一分支，但進化樹位于CPV-2和CPV-2a型之間(圖5)。

圖5 VP2基因系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of VP2 gene

對VP2氨基酸序列分析發現，該分離毒株VP2氨基酸序列的87位氨基酸為亮氨酸(L)、101位氨基酸為蘇氨酸(T)、300位氨基酸為丙氨酸(A)，305位氨基酸為天冬氨酸(D),其余細小病毒VP2蛋白常見的氨基酸突變位點與CPV-2型毒株一致(表1)。

表1 MPCPV-SX株與不同肉食獸細小病毒VP2蛋白氨基酸序列變異位點比對Table 1 Comparison of amino acid sequence variation sites of VP2 protein between MPCPV-SX strain and different Carnivorous parvoviruses

3 討 論

犬細小病毒發現于1978年，被認為是貓細小病毒的變異株，是由貓細小病毒樣病毒通過適應野生肉食動物進化而來[13-14]。CPV-2自出現以來進化迅速，一些新的抗原和基因變異體出現并在全球范圍內傳播[15-18]。出現了CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c等新型毒株。CPV除能感染犬外，還能感染狐貍、狼等犬科動物，而CPV-2a和CPV-2b還能感染貓、虎、熊、果子貍等動物。而出現這種感染宿主范圍變化的原因與新毒株VP2衣殼蛋白氨基酸變化密切相關。與CPV-2型毒株相比，所有犬源的CPV-2a 型分離毒株的VP2衣殼蛋白都具有4個獨特的氨基酸突變點，分別為87、101、300和305位氨基酸。這些變異體使新毒株不僅能感染犬科動物，且恢復了感染貓的能力(CPV-2中失去的特性)[19]。

本研究應用CRFK細胞從患有腸炎的果子貍腸道組織樣品中分離到1株病毒，通過血凝試驗、免疫熒光試驗確定分離毒株為細小病毒。果子貍在分類學上屬于靈貓科，基因進化分析其感染的病毒屬于犬細小病毒，與貓細小病毒和水貂細小病毒等距離較遠，因此在應用疫苗免疫時可考慮采用犬細小病毒預防。進一步分析其VP2基因的氨基酸序列發現，MPCPV-SX在87和101位氨基酸上與CPV-2a 相同，但在300和305位氨基酸上與CPV-2相同。VP2基因序列的系統進化樹分析也顯示了本次分離的毒株處在 CPV-2和 CPV-2a 序列之間的中間位置。

野生動物一直被認為是病毒的混合器，很多野生動物都是多種病原體攜帶者、中間宿主或是傳染源。果子貍就是其中之一，果子貍攜帶多種體內寄生蟲包括旋毛蟲、斯氏貍殖吸蟲等，其還是嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)的中間宿主及狂犬病病毒的攜帶者。病毒在果子貍體內與宿主相互作用可能對于病毒遺傳演化發揮重要作用[11,20]。細小病毒是果子貍常感染的病毒，研究報道表明果子貍可感染貓細小病毒和犬細小病毒[21]，而國內學者在果子貍中分離到細小病毒均屬于犬細小病毒，2003年趙忠鵬等[22]報道分離到果子貍細小病毒毒株PV/GZL/HN/1/02與Chen等[23]2011年所分離的果子貍細小病毒毒株MCPV(GQ502462)均屬于CPV-2a，這2株病毒VP2蛋白關鍵位點除了在300位氨基酸處有1個突變(從 Gly到Ser)外，其余均與CPV-2a型一致。而柴秀麗等[24]2008年報道從河南某地送檢的果子貍糞便中分離的2株果子貍源細小病毒PV/PL/HeN02/08(EU441279)和PV/PL/HeN03/08(EU441280)，鑒定認為屬于CPV-2a突變株，其中PV/PL/HeN02/08(EU441279)毒株與本研究所分離的毒株MPCPV-SX在這4個位置關鍵氨基酸(87、101、300和305)的突變完全一致。而另一毒株PV/PL/HeN03/08(EU441280)的4個關鍵氨基酸位點與CPV-2a 完全相同，除了在297位有一個Ser到Ala的突變。出現以上結果可能是由于不同基因型細小病毒感染果子貍后，在其體內發生基因重組引起，也有可能類似于犬細小病毒變異于貓細小病毒一樣，是CPV-2適應果子貍進化而來。果子貍源細小病毒的基因序列也可能代表了一種介于 CPV-2和 CPV-2a 之間進化中間狀態的病毒,進一步的結論還需要對不同地區來源的更多毒株的長時間監測。

4 結 論

本研究應用CRFK細胞成功從果子貍腸道組織樣品中分離到1株細小病毒，并命名為MPCPV-SX。經VP2基因和關鍵位點氨基酸序列分析表明其是介于CPV-2和CPV-2a 之間進化中間狀態的病毒。