豬流行性腹瀉病毒S2基因B細胞表位嵌入型S-層蛋白在副干酪乳桿菌中的表達與鑒定

白偉琴，卡楚拉，烏志勇，苗 苗,塔 娜，格日勒圖

(內蒙古農業大學獸醫學院，呼和浩特 010010)

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一種較常見的、侵染性較高的、具有包膜結構的、單股正鏈RNA病毒，屬于α冠狀病毒屬[1-2]?；蚪M全長約28 kb，可編碼4種主要結構蛋白，分別為纖突蛋白(S)、膜糖蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)和小膜蛋白(E)[3]。其中，S蛋白屬于一種Ⅰ型糖蛋白，分布在病毒粒子最外層，與其他冠狀病毒S蛋白一樣，PEDV S蛋白也是定位于病毒粒子表面的一種二聚體結構糖蛋白，在調節特定宿主細胞受體糖蛋白的相互作用、病原體侵入宿主細胞后的介導及刺激自然宿主誘導中和抗體產生中發揮關鍵作用[4]。在表位疫苗的研究中選定能與主要組織相容性復合體Ⅱ類(MHCⅡ)有效匹配的肽序列尤為重要，因為MHCⅡ-Ag易向輔助T細胞遞呈抗原，從而有望觸發細胞免疫和體液免疫兼備的免疫應答，因此選擇S2基因B細胞表位(EpitopeS2)作為靶位序列。

副干酪乳桿菌作為一種常見的食品級微生物，在乳制品、飲料及保健食品中均能分離到，并在食品工業中得到廣泛應用[5]。利用非致病性和侵襲性的副干酪乳桿菌作為抗原傳遞載體應用于疫苗研究領域，不僅能發揮乳酸菌本身的益生作用，還能避免制備純化病毒抗原的繁瑣流程，并有效刺激機體產生中和抗體[6]。乳酸菌S-層蛋白(S-layer protein，SLP)是蛋白質狀的細胞包膜結構[7]，可作為外部顯示的輔助蛋白和糖蛋白[8]，其作為融合蛋白還具備以下特點：首先，SLP是乳酸菌的特殊結構，能在菌體表面組裝成納米級晶格結構，將抗原表位嵌入到這些晶格中更有利于病毒抗原與宿主相關細胞接觸形成有效刺激[9]；其次，SLP具有增加宿主細菌黏附作用，可有效延遲細菌在腸道中滯留時間[10]。被廣泛應用于構建S-層融合蛋白，在人或動物的免疫接種中應用。為更好地觸發免疫應答，將EpitopeS2基因嵌入到乳酸菌SLP基因序列中構建融合基因SLP-EpitopeS2，利用SLP的佐劑效應使得表位肽更好地發揮作用。

本研究將SLP-EpitopeS2融合基因克隆到表達載體pTRK892中構建重組質粒pTRK-SLP-EpitopeS2，并將其電轉化至副干酪乳桿菌構建重組副干酪乳桿菌來表達EpitopeS2抗原蛋白，以期為PEDV新型活菌載體疫苗相關研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒 副干酪乳桿菌由本實驗室從傳統馬奶酒中分離并保存；重組質粒pGEX-SLP-EpitpeS2由本實驗室構建及保存[11]；大腸桿菌MC1061菌株、乳桿菌表達載體pTRK892均購自Addgene公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 PEDV B細胞表位單克隆抗體(McAb)委托吉爾生化(上海)有限公司制備；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠IgG、FITC標記的山羊抗鼠IgG均購自北京博奧森生物技術有限公司；蛋白質分子質量標準購自北京聚合美生物科技有限公司；增強型DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。

SDS-PAGE電泳儀購自伯樂生命醫學產品(上海)有限公司；激光共聚焦顯微鏡購自卡爾蔡司光學(中國)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據重組質粒pGEX-SLP-EpitopeS2基因序列設計引物，序列如下：F：5′-GCTGAATTCTACTAGAAAGGAAAATCATCT-ATGAAGAAAAATTTAAGAATCGTTAGCGC-TG-3′；R：5′-AGAGCGGCCGCTTATCTAAAGT-TTGCAACCTTAAC-3′，下劃線處分別為EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點。引物由上海桑尼生物工程有限公司合成。

1.2.2 重組質粒pTRK-SLP-EpitopeS2的構建及鑒定 利用上述合成的引物，以重組質粒pGEX-SLP-EpitopeS2為模板PCR擴增SLP-EpitopeS2融合基因，用限制性內切酶EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切目的基因，將目的基因與經相同酶切處理的pTRK892表達載體用T4 DNA連接酶4 ℃過夜連接，將連接產物轉化大腸桿菌MC1061感受態細胞，從含有1.5%紅霉素(Em)的LB瓊脂培養基中篩選陽性克隆，陽性克隆經擴大培養后提取質粒，進行PCR和雙酶切鑒定。

1.2.3 重組副干酪乳桿菌的構建及鑒定 將副干酪乳桿菌制備為副干酪乳桿菌感受態細胞。將重組質粒pTRK-SLP-EpitopeS2與副干酪乳桿菌感受態細胞混合冰浴5 min，將混合物轉移到預冷的電轉化杯中進行電轉化，電轉完成后添加800 μL含有0.500 mol/L蔗糖、0.020 mol/L MgCl2和0.005 mol/L CaCl2的MRS液體培養基并轉移到1.5 mL離心管中，37 ℃培養3 h。將200 μL細菌懸浮液均勻涂布于含有0.2%紅霉素的MRS固體培養基上，在37 ℃恒溫培養箱中培養48～72 h，直至形成單個菌落，將單個菌落接種于5 mL MRS液體培養基(Em+)中進行擴大培養，取少量菌液進行PCR鑒定。將鑒定正確的重組副干酪乳桿菌菌液與 50%甘油1∶1混合，-80 ℃保存。

1.2.4 SDS-PAGE鑒定重組副干酪乳桿菌中SLP-EpitopeS2的表達 將pTRK-SLP-EpitopeS2菌株進行傳代培養，二代菌以1∶100(V/V)接種于MRS液體培養基(Em+)中，37 ℃培養箱中培養36～48 h進行蛋白表達。取1 mL菌液轉移至1.5 mL離心管中，4 ℃、5 000×g離心10 min。沉淀用預冷的PBS洗滌3次，加入50 μL 1×SDS上樣緩沖液重懸沉淀，100 ℃煮沸5 min變性，冰浴5 min，12 000×g離心10 min，取20 μL蛋白質樣品進行SDS-PAGE。電泳結束后用考馬斯亮藍染色液染色1 h，考馬斯亮藍染色脫色液脫色1～2 h，觀察是否有目的蛋白。

1.2.5 Western blotting 鑒定重組副干酪乳桿菌中SLP-EpitopeS2的表達 SDS-PAGE結束后，將蛋白凝膠通過半干轉的方法轉移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，用5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，然后將NC膜于PEDV B細胞表位單克隆抗體(1∶500稀釋)中4 ℃ 孵育過夜，次日NC膜用含0.05% Tween的PBST洗滌3次，每次10 min，然后與HRP標記的山羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，用PBST洗滌3次，每次10 min。洗滌完后用增強型DAB顯色試劑盒進行顯色觀察。

1.2.6 間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定 將載玻片用多聚賴氨酸處理30 min，并將D600 nm值約為1.0的重組副干酪乳桿菌(含pTRK-SLP-EpitopeS2質粒)和對照副干酪乳桿菌(不含質粒)用4%多聚甲醛固定在載玻片上，在1∶100稀釋的PEDV B細胞表位單克隆抗體中避光孵育45 min，用PBS洗滌2次后，樣品在1∶100稀釋的FITC標記的山羊抗鼠IgG 抗體中避光孵育30 min，并用PBS洗滌3次，然后通過激光共聚焦顯微鏡觀察和拍照記錄。

1.2.7 重組副干酪乳桿菌膜蛋白提取及鑒定 參考尹瓊芳等[12]氯化鋰(LiCl)提取SLP的方法,將擴大培養的重組副干酪乳桿菌菌液分裝至50 mL離心管中，4 ℃、5 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀，沉淀用預冷的PBS洗滌3次，用8 mL 4 mol/L 的LiCl重懸菌沉淀，室溫搖床孵育1 h，孵育結束后4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清。上清液于0.01 mol/L PBS(pH 7.4)中4 ℃透析，用聚乙二醇濃縮蛋白樣品溶液，取少量蛋白用1.2.4和1.2.5的方法分別進行SDS-PAGE和Western blotting鑒定。

2 結 果

2.1 重組質粒pTRK-SLP-EpitopeS2鑒定結果

重組質粒pTRK-SLP-EpitopeS2 PCR鑒定結果顯示，成功擴增出大小為1 400 bp的條帶，與插入的SLP-EpitopeS2融合基因大小一致；EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定結果顯示，獲得大小分別為1 400 和4 700 bp的條帶(圖1)，與預期大小相符，測序結果與預期結果一致，不存在堿基缺失和基因突變，表明重組質粒pTRK-SLP-EpitopeS2構建成功。

M1，DL2000 DNA Marker；1，重組質粒PCR產物；2，陰性對照；M2，DL5000 DNA Marker；3，重組質粒雙酶切產物 M1，DL2000 DNA Marker；1，PCR product of recombinant plasmid；2，Negative control；M2，DL5000 DNA Marker；3，Double enzyme digestion products of recombinant plasmid圖1 重組質粒pTRK-SLP-EpitopeS2鑒定結果Fig.1 Identification results of recombinant plasmid pTRK-SLP-EpitopeS2

2.2 重組副干酪乳桿菌鑒定結果

經電轉化得到的單菌落稀釋后進行 PCR 鑒定，在1 400 bp 處出現目的條帶(圖2)，表明重組質粒pTRK-SLP-EpitopeS2成功轉入副干酪乳桿菌中。

2.3 SDS-PAGE鑒定SLP-EpitopeS2的表達

SDS-PAGE鑒定結果顯示，重組副干酪乳桿菌在48 ku處出現一條明顯的條帶，與目的蛋白預計大小相符，而副干酪乳桿菌陰性對照則在相應位置處沒有出現條帶(圖3A)，根據SDS-PAGE結果可初步判定SLP-EpitopeS2融合基因在副干酪乳桿菌中得到了表達。

2.4 Western blotting 鑒定SLP-EpitopeS2的表達

Western blotting結果顯示，重組副干酪乳桿菌可與PEDV B細胞表位單克隆抗體進行特異性結合，在48 ku處出現一條高特異性的條帶，而副干酪乳桿菌陰性對照則未出現任何條帶(圖3B)。表明融合基因SLP-EpitopeS2在副干酪乳桿菌中成功表達。

M，DL2000 DNA Marker；1、2，重組副干酪乳桿菌PCR產物；3，副干酪乳桿菌PCR產物 M，DL2000 DNA Marker；1 and 2，PCR products of recombinant Lactobacillus paracasei；3，PCR product of Lactobacillus paracasei圖2 重組副干酪乳桿菌鑒定Fig.2 Identification of recombinant Lactobacillus paracasei

M，蛋白質分子質量標準；1、2，陰性對照；3，SLP-EpitopeS2蛋白表達 M，Protein Marker；1 and 2，Negative control；3，SLP-EpitopeS2 protein expression圖3 SLP-EpitopeS2蛋白表達的SDS-PAGE(A)和Western blotting(B)鑒定Fig.3 SDS-PAGE (A) and Western blotting (B) identification of SLP-EpitopeS2 protein expression

2.5 IFA結果

IFA結果顯示，重組副干酪乳桿菌幾乎全部被激發出了綠色熒光信號，而副干酪乳桿菌對照則沒有出現相應的綠色熒光信號(圖4)，根據結果判斷融合基因SLP-EpitopeS2可能表達于副干酪乳桿菌表面。

A,綠色熒光下重組副干酪乳桿菌；B,白光下重組副干酪乳桿菌；C,綠色熒光下對照菌；D,白光下對照菌 A,Recombinant Lactobacillus paracasei under green fluorescence；B,Recombinant Lactobacillus paracasei under white light；C,Negative control under green fluorescence；D,Negative control under white light圖4 重組副干酪乳桿菌IFA鑒定(400×)Fig.4 IFA identification of recombinant Lactobacillus paracasei (400×)

2.6 重組副干酪乳桿菌膜蛋白鑒定結果

重組副干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌對照經過LiCl處理后進行SDS-PAGE和Western blotting鑒定，結果重組副干酪乳桿菌在48 ku處出現明顯的蛋白條帶，結合IFA結果推測融合基因表達于副干酪乳桿菌菌體表面(圖5)。

M,蛋白質分子質量標準；1，重組菌膜蛋白；2，對照菌膜蛋白；3，重組菌培養上清；4，對照菌培養上清 M，Protein Marker；1，Membrane protein of recombinant bacteria；2，Membrane protein of control bacteria；3，Culture supernatant of recombinant bacteria；4，Culture supernatant of control bacteria圖5 膜蛋白中重組SLP-EpitopeS2的SDS-PAGE(A)和Western blotting(B)檢測結果Fig.5 SDS-PAGE (A) and Western blotting (B) detection results of recombinant protein SLP-EpitopeS2 in membrane protein

3 討 論

過去的幾十年，豬流行性腹瀉給全球養豬業造成了巨大的經濟損失[13]，引起了公眾的高度重視。接種疫苗仍是預防和控制PEDV最有效的方法[14]。近年來，國內外研究者在PEDV疫苗研究方面作了大量的研究工作，研制了不同種類的疫苗[15]，對控制流行性腹瀉起到了良好的預防作用。隨著分子生物學技術的不斷發展，傳統的滅活疫苗及減毒活疫苗在不久的將來可能會被基因工程疫苗等新疫苗替代。滅活疫苗雖然安全無毒，也能刺激機體產生免疫保護作用，但免疫周期短，保護效果不佳[16]，減毒疫苗如果減毒不完全還可能引起疾病感染[17]，然而，表位疫苗安全穩定，其分子質量較小，不會引起機體的免疫抑制及排斥反應[18]。由于表位肽本身免疫原性不高,因此可選用嗜酸乳桿菌SLP進行融合，增強其免疫原性。

乳酸菌是一類被公認的、安全的、對動物和人體有益的微生物，在自然界中廣泛存在[19]，且與腸道健康密切相關，能依賴自身在腸道中的定植特性定植于胃腸道中，通過自身的發酵功能分泌有機酸、抗菌素、維生素和具有生物活性的肽等物質，乳酸菌向宿主釋放的物質可抵抗有害菌的生長繁殖，從而維持腸道內環境的穩定，調節胃腸道中的菌群平衡[20]。其中副干酪乳桿菌作為正常的腸道菌群，適應胃腸道中高鹽、高酸性的環境，可在胃腸道環境中生存增殖，抗原蛋白也隨著菌體的復制而得到復制，并不斷向宿主釋放抗原蛋白。若將其開發成口服疫苗將是一個新的突破。Guo等[21]將PEDVS1基因克隆到乳球菌表達載體pNZ8149中構建重組質粒pNZ8149-S1，并將重組菌免疫BALB/c小鼠評價免疫原性，結果顯示，重組乳酸乳球菌可誘導機體產生較高水平的體液免疫和黏膜免疫應答。Li等[22]將PEDVS基因克隆到乳酸菌表達載體pVE5523中，免疫小鼠評價免疫原性，與Guo等[21]研究結果相似，可高水平地誘導體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫。上述試驗結果雖證明重組乳酸菌免疫小鼠能產生較高水平的體液免疫、黏膜免疫應答，但存在由于插入片段大而導致對PEDV野外變異株的特異性差和抗原蛋白的表達量不高等瓶頸問題。

本試驗首先擴增出融合基因SLP-EpitopeS2，并將其克隆到乳桿菌表達載體pTRK892中，構建了重組質粒pTRK-SLP-EpitopeS2，并將其轉入副干酪乳桿菌中進行目的蛋白的表達。應用食品級副干酪乳桿菌作為載體菌可避免抗原蛋白的純化等繁瑣流程，且選擇表位基因在某種程度上可克服病毒變異所帶來的中和病毒效率低等關鍵問題。SDS-PAGE和Western blotting 結果顯示，在相應位置處出現特異性目的條帶，與多克隆抗體相比，選用單克隆抗體進行Western blotting鑒定可有效減少與其他雜蛋白的交叉反應，提高試驗結果的準確性，根據與單克隆抗體抗的特異性結合，表明融合蛋白SLP-EpitopeS2還具備抗原性。在IFA中，成功解決了S2基因 B細胞表位肽在副干酪乳桿菌中能否有效表達的定性問題，與副干酪乳桿菌對照相比，重組副干酪乳桿菌絕大多數菌體都能激發出綠色熒光信號。但遺憾的是由于實驗室激光共聚焦顯微鏡的性能參數所限，未能更準確地證實S2表位肽是否在乳酸菌膜上定位問題。為補充證實該問題，使用4 mol/L高濃度的LiCl處理重組副干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌對照，非特異性洗脫出乳桿菌表面上的膜蛋白，在這種高濃度的LiCl洗脫條件下，菌體表面混雜的膜蛋白幾乎都被洗脫下來，但對細菌細胞膜的損傷甚微[23]。所以結合單克隆抗體高特異性識別目的融合蛋白，推測融合蛋白SLP-EpitopeS2可能在副干酪乳桿菌菌體表面表達。表達量高且展示于載體菌膜表面的蛋白是開發口服疫苗較高的優勢[24]，但由于本試驗尚未進行動物試驗而不能確定重組副干酪乳桿菌作為口服疫苗能否有效刺激機體產生高水平的免疫應答。在今后還需通過進一步試驗確定其免疫原性。

4 結 論

本試驗選擇乳酸菌表達載體pTRK892成功構建了PEDV EpitopeS2 B細胞表位嵌入型SLP融合表達載體，并成功在副干酪乳桿菌中表達，為今后進行PEDV 新型活菌載體疫苗研究奠定了基礎。