口蹄疫病毒感染與免疫鑒別診斷及免疫評價二聯試紙的優化

楊蘇珍，孫亞寧，劉運超，柴書軍，張改平,2,3

(1.河南省農業科學院，動物免疫學重點實驗室，鄭州 450002；2.河南農業大學牧醫工程學院，鄭州 450002；3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009)

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是危害豬、牛、羊等主要家畜畜種的疫病，口蹄疫的流行可造成巨大的經濟損失和政治影響，引發嚴重的負面社會影響，因此被列在一類動物疫病的首位[1]。中國豬、牛、羊養殖量最大、鄰國眾多，防控口蹄疫不僅對本國農牧業發展起關鍵作用，而且對全球口蹄疫防控有重要意義[2]。目前，除一些發達國家消滅了口蹄疫并保持著無疫狀態外，口蹄疫仍在眾多發展中國家流行或散發[3]。

疫苗免疫是防控口蹄疫的主要手段。早期使用的疫苗主要是弱毒疫苗，因其存在與流行毒重組和更替畜主返強的潛在風險，以及活毒的持續感染妨礙疫源凈化等缺陷，20世紀70年代后逐漸被滅活疫苗取代[4]。口蹄疫滅活疫苗是目前使用的主要疫苗，在口蹄疫防控中發揮了重要作用。歐洲經歷十多年的滅活疫苗接種后，疫情得到了有效控制，多數國家達到無疫標準。在此情況下，歐洲共同體雖然于1991年停止了疫苗的使用，可疫苗庫中始終留存戰備疫苗[5]。南美也有一些國家使用滅活疫苗，有效控制了疫情，取得了無口蹄疫國家地位。在使用口蹄疫疫苗的國家，勢必要進行疫苗免疫效果評價和感染動物與免疫動物鑒別診斷[6-7]。目前國內外有多種商品化的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒，大體上分為兩類：一類是結構蛋白抗體檢測ELISA試劑盒和液相阻斷ELISA試劑盒，用于評價疫苗免疫效果[7-8]；另一類是非結構蛋白抗體檢測ELISA試劑盒，用于口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)感染動物與免疫動物的鑒別診斷[8]。為了使檢測方法更加簡便，進一步降低檢測成本，節約檢測時間，河南省農業科學院動物免疫學實驗室已成功建立了一種FMDV感染與免疫鑒別診斷及免疫評價二聯試紙[9]，為使該試紙商品化，本研究進一步對該試紙的膠體金墊的處理液、金標蛋白的緩沖液、樣品墊的緩沖液、噴膜蛋白的稀釋液以及樣品稀釋液進行優化，為基層FMDV的檢測提供簡便的方法，為口蹄疫的防控贏得寶貴的時間。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

氯金酸(HAuCl4·H2O)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、酪蛋白(casein)、金黃色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcusaureusprotein A，SPA)和檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7·2H2O)均購自鄭州慧耕達生物科技有限公司；硝酸纖維素膜(HF13502S25，30 cm×2 cm)、吸水紙和玻璃纖維購自上海金標生物科技有限公司；口蹄疫O型抗體液相阻斷ELISA(LPB ELISA)檢測試劑盒和3ABC阻斷ELISA(3ABC ELISA)抗體檢測試劑盒均購自蘭州獸研生物科技有限公司；四硼酸鈉(Na2B4O7·10H2O)、十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、二水合磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、疊氮化鈉(NaN3)、曲拉通100(Trition X-100)等均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器

三維噴點系統(BioDot-XYZ3060)、讀條儀(BioDot-TSR3000)、壓殼機(HGS802)、紫外可見分光光度計(U-3000)和斬切機(BioDot-CM 4000)均購自杭州峰航科技有限公司；離心機(SIGMA4-16K)和定時恒溫雙向磁力攪拌器(93-3)均購自上海亞榮生化儀器廠；電熱鼓風干燥箱(101-2AB)購自上海一恒科學儀器有限公司；薄膜連續封口機(900型)購自廣州華豐包裝設備有限公司；加熱磁力攪拌器(JB-SX)購自南北儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試紙原理 根據FMDV結構蛋白(structural protein，SP)VP1和非結構蛋白(Non-structural protein，NSP)2B、3B、3C上主要抗原表位，按照市場上現有幾種FMDV疫苗毒株序列，設計合成4條結構蛋白多肽和5條非結構蛋白多肽，并在氨基端加入半胱氨酸，將合成并純化的多肽與BSA載體蛋白偶聯。將BSA-SPs抗原和BSA-NSPs抗原分別作為檢測線1(test line 1，T1)和檢測線2(test line 2，T2)，FMDV單克隆抗體IgG作為質控線(control line，C)，膠體金標記SPA作為探針建立FMDV抗體評價和感染與免疫鑒別診斷二聯試紙。試紙模式和原理見圖1。

1.3.2 金標物的優化 在雙抗體或多種抗體檢測系統中，金標蛋白需要同時結合多種抗體，本系統選擇了能結合豬IgG的羊抗豬IgG和SPA，分別用生理鹽水稀釋成濃度為1.0 mg/mL，取2個離心管，每管加入1 mL用K2CO3調整過pH的膠體金(GNP)溶液，將稀釋好的羊抗豬IgG和SPA溶液分別緩慢加入膠體金中，每管10 μL。按照張改平[10]報道方法進行膠體金標記后，分別按照1.5、1.0、0.5 μL/條將金標蛋白點在試紙條上，檢測FMDV陽性血清和陰性質控血清，對比檢測結果，根據檢測結果的特異性和敏感性，選擇最適的蛋白和最佳用量作為最佳標記用量。

1.3.3 金標蛋白保存液的篩選 不同的金標蛋白保存液對金標蛋白的穩定性、特異性、敏感性都有影響，本研究根據所標記蛋白的性質，設計4種金標蛋白保存液(表1)。操作方法：分別向1 mL 的膠體金溶液中緩慢地加入5 μL濃度為1 mg/mL的蛋白溶液(共4管)，反復吹打混勻后，室溫放置30 min；加入100 μL 50 g/L酪蛋白封閉液，混勻，室溫靜置10 min；12 000 r/ min，4 ℃離心20 min，棄上清；4管沉淀分別用100 μL 1～4號金標蛋白保存液重懸，將重懸的金標蛋白溶液室溫放置7 d，觀察金標蛋白狀態，并組裝試驗用試紙，檢測質控血清，根據敏感性、特異性和穩定性檢測結果選擇最佳的金標蛋白保存液。

1.3.4 感染檢測線(T2)多肽抗原的篩選 在本試紙系統中，T2檢測線用來鑒別FMDV感染和免疫動物，選用了FMDV非結構蛋白2B、3B、3C上的5個抗原表位偶聯載體蛋白BSA(BSA-NSPs)作為抗原，為篩選這5個多肽抗原的最佳使用方法，分別將5種多肽抗原用生理鹽水稀釋為0.5 mg/mL，噴膜做檢測線，檢測FMDV O型感染血清、FMDV O型免疫血清和陰性血清，對比檢測結果，篩選特異性和靈敏度較高的抗原，并優化噴涂條件，對比等量混合多肽噴涂效果，選擇T2檢測線的多肽抗原；并進一步優化篩選到的多肽噴膜量，按1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL的量噴膜，分別檢測FMDV O型感染血清和陰性血清，根據特異性和靈敏度選擇最佳噴膜劑量。

①A，試紙結構圖；B，試紙原理圖；C，試紙顯色結果圖。②T1檢測線，非結構蛋白表位抗原(BSA-NSPs)印跡；T2檢測線，結構蛋白表位抗原(BSA-SPs)印跡。1，O型FMDV感染血清檢測結果；2，FMDV感染血清(O型除外)檢測結果；3，O型FMDV免疫血清檢測結果；4，FMDV陰性血清檢測結果 ①A，Structure diagram of the test strip；B，Principle diagram of the test strip；C，Test results of the test strip.②T1 line，BSA-NSPs antigen；T2 line，BSA-SPs antigen；1，The test result of FMDV type O infected serum；2，The test result of FMDV infected but not type O serum；3，The test result of FMDV type O immunized serum；4，The test result of FMDV negative serum圖1 試紙原理圖Fig.1 Principle diagram of the immunocromatographic strip

表1 金標蛋白保存液配方Table 1 Formulations of colloidal gold-labeled protein preservation solution

1.3.5 多肽抗原稀釋液的篩選 BSA偶聯后的SP、NSP多肽抗原，用微量分光光度計測定蛋白濃度。分別用PBS、生理鹽水、CBS和0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液溶解為1 mg/mL的溶液，噴于硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrane，NC)上，42 ℃干燥40 min，制成T1、T2印跡，組裝成試驗用試紙，檢測免疫血清、感染血清以及陰性血清，選擇特異性和靈敏度較高組對應的緩沖液為多肽抗原稀釋液。

1.3.6 兩條檢測線(T1、T2)蛋白位置優化 多聯檢測中，檢測線上蛋白會互相影響，從而出現假陽性或假陰性結果，為了檢測結果的準確性，試驗優化了攔截抗原位置。按照1.3.3、1.3.4和1.3.5篩選到的條件，在T1、T2兩條檢測線上分別噴涂BSA-SPs及BSA-NSPs多肽抗原，組裝試紙，檢測FMDV O型和A型感染血清及O型免疫血清，探索兩種多肽抗原位置對檢測結果的影響，確定兩條檢測線噴涂抗原蛋白。

1.3.7 樣品墊緩沖系統的篩選 將切割好的玻璃纖維棉，分別浸泡于3種不同配方的緩沖液中(表2)，5 min后取出，42 ℃鼓風干燥箱中干燥4 h，分別與制備好的各組分組裝成試紙，檢測試紙靈敏度，確定較優緩沖液配方。

表2 樣品墊緩沖液配方Table 2 Formulations of buffer systems of sample pad

1.3.8 樣品稀釋液優化 血清樣品的基礎稀釋液為生理鹽水。在本試紙檢測中，以生理鹽水為稀釋液稀釋的標準血清顯色稍淺，為增加顯色強度，改善檢測靈敏度，在生理鹽水的基礎上分別加入1.0% 的Tween-20和1.0% 的PEG20000配制2種新的樣品稀釋液，并與生理鹽水對照檢測效果。以豬O型FMDV陽性和陰性質控血清為樣品，分別用上述3種稀釋液稀釋后用試紙檢測，選擇無非特異性且顯色最深的稀釋液作為樣品稀釋液。

1.3.9 試紙與商品ELISA試劑盒的對比試驗 以優化后的試紙檢測266份田間豬血清樣品，并與口蹄疫O型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒(LPB ELISA)和3ABC阻斷ELISA抗體檢測試劑盒(3ABC ELISA)檢測結果進行對比，計算該試紙與商品ELISA試劑盒的符合率。

2 結 果

2.1 金標蛋白的優化結果

采用膠體金標記的羊抗豬IgG和SPA，對FMDV陽性血清和陰性血清的檢測結果顯示，金標SPA的在試紙系統中的顯色較深，敏感性優于羊抗豬IgG，且無非特異反應，因此選擇金標SPA作為探針用于本試紙系統，在3種不同的金標SPA用量中，0.5 μL/條顯色較淺，1.5 μL/條和1.0 μL/條顯色無明顯差別，為保證試紙的特異性，本系統選用1.0 μL/條的金標SPA(圖2)。

1,FMDV陰性血清；2，FMDV陽性血清 1，FMDV negative serum；2，FMDV positive serum圖2 金標蛋白優化試驗結果Fig.2 Results of gold-labeled protein optimization test

2.2 金標蛋白保存液的篩選結果

由圖3可知，1號和3號金標保存液重懸金標蛋白穩定性差，已形成肉眼可見的板結，不能用于檢測，2號和4號金標保存液重懸金標蛋白呈酒紅色、透亮無沉淀，狀態穩定，可用于檢測。2號和4號金標保存液重懸金標蛋白，每條點金1 μL，檢測1∶200倍稀釋的FMDV陰、陽性質控血清(表3)，結果顯示2號保存液重懸的金標蛋白的特異性優于4號，無非特異反應，所以選用2號金標蛋白保存液。

圖3 金標蛋白保存液的篩選試驗Fig.3 The screening test of preservation solutions of colloidal gold-labeled protein

2.3 感染檢測線多肽的篩選結果

采用偶聯BSA的5種非結構蛋白多肽抗原(BSA-NSP1、BSA-NSP2、BSA-NSP3、BSA-NSP4、BSA-NSP5)檢測FMDV感染血清和陰性血清，篩選結果顯示，BSA-NSP1、BSA-NSP2、BSA-NSP5能與FMDV抗體特異性結合(圖4)。將3種多肽抗原單獨及等量混合后作為檢測線，結果顯示，這3種多肽抗原單獨及等量混合后作為攔截線顯色強弱無明顯差別(圖5A)，可以混合使用。為了檢測的廣譜性，將3種多肽抗原混合(BSA-NSPs)后作為感染檢測線。進一步優化噴涂量，結果顯示，1.0 mg/mL蛋白噴膜時，陰性血清有非特異性顯色，0.5 mg/mL蛋白噴膜時，陽性血清顯色與1.0 mg/mL蛋白噴膜時無明顯差異，且陰性血清無非特異性反應(圖5B)，因此選擇0.5 mg/mL為最佳噴膜劑量。

表3 金標蛋白保存液穩定性試驗結果Table 3 Stability detection results of preservation solutions of colloidal gold-labeled protein

1,FMDV O型感染血清；2，FMDV O型免疫血清；3，FMDV陰性血清。圖5同 1，FMDV type O infected serum；2，FMDV type O immunized serum；3，FMDV negative serum. The same as fig.5圖4 5條多肽初步篩選結果Fig.4 Preliminary screening results of the five peptides

2.4 多肽抗原稀釋液的篩選

試驗結果顯示，4種稀釋液對FMDV O型免疫血清的敏感性和特異性影響不大，敏感性都為1∶12 800，陰性血清檢測結果都為陰性，無非特異性反應。檢測FMDV O型感染血清時，含生理鹽水、PBS和CBS的緩沖液檢測結果相似，試紙靈敏度均為1∶3 200，無非特異反應。使用含Tris-HCl的稀釋液時，試紙靈敏度可達1∶6 400，且無非特異反應。因此，T1、T2都用0.1 mol/L Tris-HCl配制成0.5 mg/mL的蛋白溶液(表4)。

A，多肽抗原的篩選；B，多肽抗原用量的篩選 A，Rescreening results of peptide antigen;B，Rescreening results of the amount of the peptide antigen圖5 3條多肽復篩結果Fig.5 Rescreening results of the three peptides

表4 不同抗原稀釋液篩選結果Table 4 Screening results of different antigen dilutions

2.5 兩條檢測線(T1、T2)蛋白位置優化結果

由表5可知，當T2線位置上噴涂非結構蛋白多肽抗原(BSA-NSPs)，T1線上噴涂結構蛋白多肽抗原(BSA-SPs)時，檢測FMDV O型免疫血清時，T2線出現非特異性反應；當T2線位置上噴涂結構蛋白多肽抗原(BSA-SPs)，T1線上噴涂非結構蛋白多肽抗原(BSA-NSPs)時，檢測結果準確，因此選擇檢測線T1為非結構蛋白多肽抗原，T2為結構蛋白多肽抗原。

表5 兩條檢測線位置優化試驗Table 5 Position optimization test of the two test lines

2.6 樣品墊緩沖系統優化結果

常用的3種試紙緩沖系統中，3號顯色弱，1號檢測陰性血清有很弱的非特異性，2號顯色最強，且無非特異性(圖6)，因此選擇2號試紙緩沖系統。

2.7 樣品稀釋液優化結果

3種樣品稀釋液篩選結果顯示，生理鹽水顯色較淺，生理鹽水中加入1.0%的PEG20000時有非特異性反應，加入1%Tween-20時既能增加試紙顯色又無非特異性(圖7)，因此，選用生理鹽水加1%Tween-20作為本試紙的樣品稀釋液。

2.8 試紙與商品ELISA試劑盒的符合率

優化后的試紙與兩種商品化ELISA試劑盒對比試驗結果見表6，在266份血清檢測結果中，本研究優化后的試紙條與3ABC ELISA試劑盒檢測結果一致的有256份，二者的符合率為96.20% (256/266)，與LPB ELISA 試劑盒檢測結果一致的有251份，符合率為94.36% (251/266)。

1,FMDV O型感染血清；2，FMDV A型感染血清；3，FMDV免疫血清；4，FMDV陰性血清。圖7同 1，FMDV type O infected serum；2，FMDV type A infected serum；3，FMDV immunized serum；4，FMDV negative serum. The same as fig.7圖6 樣品墊緩沖液篩選結果Fig.6 Screening results of sample pad buffer systems

圖7 樣品稀釋液優化試驗結果Fig.7 Optimization test results of sample dilutions

表6 試紙與商品ELISA試劑盒的對比試驗結果Table 6 The comparison experiment results of the strip and commercial ELISA kits 份

3 討 論

發展中國家控制FMD的主要手段是疫苗免疫[11]，對于FMDV疫苗免疫的動物，勢必要做免疫效果評價和疫苗免疫動物與病毒感染動物的鑒別診斷。目前，中國通用的FMDV抗體評價的主要方法是液相阻斷ELISA法，鑒別FMDV感染與免疫動物的主要方法是非結構蛋白抗體檢測的間接ELISA和競爭ELISA方法[2，12]，這些方法敏感且特異性好，唯一的不足就是檢測周期較長，需要專業的技術人員和檢測實驗室。本試紙的建立和優化在借鑒這些ELISA方法的特異、敏感等優勢的基礎上，進一步實現了快速、簡便的特點，任何人都可以隨時隨地進行檢測，并用肉眼進行結果判斷，不需要借助任何儀器[13-14]。

目前關于抗體檢測的產品多為單靶標檢測，大大影響了免疫層析檢測的快速及簡便性，也增加了檢測的成本，建立多聯檢測已經成為免疫層析試紙發展的趨勢[15]。但是成功制備多聯檢測免疫層析試紙是一個具有挑戰的、復雜的過程，其中最關鍵的就是檢測抗原的選擇及質量，抗原的質量直接決定著產品檢測的特異性及靈敏度[16]；其次是免疫層析試紙的緩沖系統，包括膠體金標記、金標蛋白干燥及樣品墊處理過程中的緩沖體系、蛋白、小分子保護物質、高分子聚合物及表面活性劑等，任何一個環節都將影響免疫層析試紙最終的檢測靈敏度、準確性及穩定性[17-20]。

抗原蛋白是抗體檢測的核心，經過鑒定、篩選、優化得到了能與FMDV抗體特異性結合的表位多肽，為使多肽更加穩定，通過偶聯技術將其與載體蛋白偶聯制備了穩定的抗原蛋白。此外，制備本試紙的難點是感染抗體和免疫抗體同步檢測，所以需要同一種金標蛋白能同時結合兩種抗體，同時選擇的攔截線又能夠準確地區分出兩種抗體，因此本研究選擇了間接法模式，利用SPA能夠特異結合哺乳動物IgG Fc片段的特點[21]，通過膠體金標記的SPA結合被檢樣品中的IgG，當膠體金-SPA-IgG復合物遷移至檢測線抗原蛋白時，檢測線上的結構蛋白抗原和非結構蛋白抗原分別結合特異性抗體，從而區分出感染抗體和免疫抗體。為使檢測更加特異靈敏，本研究進一步優化了兩條檢測線的位置和使用比例。

本試紙通過系統地優化各種緩沖液體系、蛋白、小分子保護物質、高分子聚合物及表面活性劑等，制備了高度特異、敏感、穩定的FMDV感染與免疫鑒別診斷及免疫評價二聯試紙。優化過程中發現噴膜緩沖液中離子的種類對抗原在NC膜上的結合效率有影響；樣品墊緩沖系統中，緩沖液及保護蛋白的種類對試紙檢測靈敏度及特異性影響較大，樣品稀釋液中加入Tween-20可以增加檢測的靈敏度。

4 結 論

本研究經過對FMDV感染與免疫鑒別診斷及免疫評價二聯試紙的優化，確定了該試紙的工藝參數：膠體金標記SPA蛋白，濃度為1 mg/mL；金標蛋白保存液選用ddH2O含15 mg/mL BSA、13.25 mg/mL Na2HPO4·12H2O、15.9 mg/mL NaH2PO4·2H2O、0.3 mg/mL NaN3和10% Trition X-100；多肽抗原稀釋液為0.1 mol/L Tris-HCl，將T1、T2檢測線蛋白均配制成0.5 mg/mL的蛋白溶液；樣品墊緩沖液為10 mg/mL酪蛋白、5% Trition X-100、0.3 mg/mL NaN3，溶于0.02 mol/L Na2B4O7·10H2O 中；樣品稀釋液選用生理鹽水含1.0% Tween-20溶液。經優化后的試紙與3ABC阻斷ELISA抗體檢測試劑盒的符合率為96.20%，與口蹄疫O型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒的符合率為94.36%。本研究為該試紙的批量生產和產業化應用奠定了基礎，為基層FMDV的檢測提供穩定、特異、敏感、準確的檢測方法。