H9N2亞型禽流感病毒NP蛋白原核表達及多克隆抗體制備

楊 景，張新宇，梁志鵬，程 晴，王聰穎，池仕紅，袁 生，郭錦玥，黃淑堅，溫 峰

(佛山科學技術學院生命科學與工程學院，佛山 528225)

H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是近年來對家禽危害最大、傳播范圍最廣的一種低致病性禽流感病毒(Low pathogenic avian influenza virus,LPAIV)[1]。中國最早于1992年由陳伯倫等[2]在雞群分中離出H9N2亞型AIV，隨后該亞型AIV在中國各個省份廣泛傳播，給養禽業造成嚴重的危害[3-4]。雖然H9N2亞型AIV在人上所引起的癥狀較輕[5-6]，也未曾在人群中有效傳播，但它可以為H7N9、H5N6等高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)提供內部基因[7-9]，可見其對公共衛生安全也造成了不容忽視的潛在危害。因此，對于H9N2亞型AIV疫情的監測和防控工作至關重要。

本研究前期在華南地區分離到1株新型H9N2亞型AIV變異株，其基因組是由G1、Y280和F98系病毒三源重組產生的[10]。值得注意的是，幾乎所有人類感染的H9N2亞型AIV均來自G1和Y280系[11-12]。流感病毒的核蛋白(nucleo protein,NP)在AIV感染宿主細胞過程中發揮著重要的作用。NP可以結合聚合酶蛋白復合體形成病毒核糖核蛋白(viral ribonucleoprotein,vRNP)復合物進入宿主細胞，并在細胞核中進行轉錄[13]。NP蛋白在不同亞型AIV間的保守度超過90%[14]，且H9N2常為其他亞型AIV提供內部基因(包括NP在內)[15]，NP蛋白的單克隆抗體常被應用于AIV血清學及分子生物學檢測[16-17],因此NP蛋白適合作為AIV通用檢測方法的靶蛋白。本研究針對近期分離到的新型H9N2亞型AIV的NP蛋白進行了原核表達及多克隆抗體制備，以期為建立AIV通用血清學檢測方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

pMD18T-BS/19-NP由佛山科學技術學院預防獸醫學實驗室構建并保存；原核表達載體pET-32a(+)、大腸桿菌Top10感受態細胞均由佛山科學技術學院預防獸醫學實驗室保存；大腸桿菌BL21(DE3)和E.coliRosetta(DE3)感受態細胞均購自南京諾唯贊科技股份有限公司；高保真PCR酶、膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒均購自Thermo Fisher Scientific公司；BamH Ⅰ、SalⅠ及T4連接酶均購自NEB公司；IPTG、His標簽抗體、HRP標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、蛋白分子質量標準、考馬斯亮藍快速染色液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、弗式佐劑均購自上海碧云天生物技術有限公司；NP蛋白單克隆抗體購自北京義翹神州科技股份有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PMSF、ECL顯色液均購自上海百賽生物技術有限公司。80日齡健康雌性新西蘭大白兔購自廣東省醫學實驗動物中心(許可證號：SCXK(粵)2019―0035)。動物試驗經佛山科學技術學院(許可證號：SYXK(粵)2020―0235)實驗動物倫理委員會批準。

1.2 引物設計與合成

根據BS/19NP基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，上、下游引物分別添加BamH Ⅰ和SalⅠ酶切位點(下劃線處)。引物序列為：H9N2-NP-F：5′-CGCGGATCCATGGCGTCTCA-AGGCAC-3′；H9N2-NP-R：5′-CCGGTCGACTT-TCTTTAATTGTCATACTCC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 NP蛋白原核表達載體構建

以pMD18T-BS/19-NP為模板擴增H9N2亞型AIV的NP基因。PCR反應體系25 μL：高保真PCR酶12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.25 μL，模板質粒(0.1 ng/μL)1 μL，ddH2O 9 μL。PCR反應條件：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，將其克隆至pMD18-T載體，重組質粒命名為pMD18T-H9N2-NP。將帶有酶切位點的pMD18T-H9N2-NP質粒與原核表達載體pET-32a(+)分別用BamH Ⅰ和SalⅠ雙酶切。按照T4 DNA連接酶說明書在16 ℃連接12 h。連接產物轉化大腸桿菌Top10感受態細胞，培養后提取重組質粒，命名為pET-32a-H9N2-NP，經酶切鑒定后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 NP蛋白誘導表達

將重組質粒pET-32a-H9N2-NP同時轉化大腸桿菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受態細胞，取含pET-32a-H9N2-NP及pET-32a(+)空載體質粒的大腸桿菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)菌液，按1∶100(V/V)分別接種至含Amp的LB培養基，37 ℃、220 r/min振蕩培養約3 h(至菌液D600 nm值為0.6)，取1 mL菌液作為未誘導對照，其余菌液加入終濃度為1 mmol/L的IPTG后，37 ℃、220 r/min振蕩培養誘導4 h。4 ℃、8 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀進行12% SDS-PAGE分析。

1.5 NP蛋白Western blotting鑒定

菌體蛋白經12% SDS-PAGE分離后轉印到PVDF膜上，采用5%脫脂奶粉在搖床室溫封閉2 h后，用PBST沖洗3次；分別采用His標簽抗體和NP蛋白抗體作為一抗，4 ℃孵育過夜，用PBST沖洗3次；以HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)為二抗，在搖床室溫孵育2 h，用PBST沖洗3次；采用ECL顯色液進行化學發光顯色，鑒定目的蛋白。

1.6 表達條件的優化及可溶性分析

為提高NP蛋白的表達量，對誘導劑IPTG濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 mmol/L)、誘導時間(1、2、3、4、5、6、7、8 h)進行優化，同時作未誘導對照，并比較16、25與37 ℃時蛋白在破碎上清和沉淀中的表達差異。各條件下的樣品經12% SDS-PAGE分離及考馬斯亮藍染色后進行分析。

1.7 蛋白純化、復性及濃縮

在優化的條件大量誘導表達重組蛋白，收集菌體沉淀，超聲破碎后，將包涵體蛋白用8 mol/L尿素變性，在變性條件下采用鎳柱親和層析的方法進行蛋白純化；將純化后的蛋白裝入透析袋中，在6、4、2、0 mol/L尿素濃度下進行復性；將蛋白包埋在PEG20000中濃縮至目標體積，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，―80 ℃保存備用。

1.8 兔多克隆抗體的制備及評價

以1 mg/只的劑量將純化的重組NP蛋白經皮下多點注射免疫新西蘭大白兔。首免采用等體積弗氏完全佐劑乳化蛋白；首免14、28 d后采用弗式不完全佐劑乳化蛋白，進行二免和三免；三免7 d后進行心臟采血分離血清。分別以純化后的NP蛋白和H9N2亞型AIV病毒液作為抗原，以制備的兔多克隆抗體作為一抗，按1.4方法進行Western blotting分析。將H9N2亞型AIV接種96孔板MDCK細胞，感染24 h后每孔加入100 μL的甲醇、丙酮混合液(1∶1)固定細胞。將自制兔抗NP血清用PBS從1∶100(V/V)開始進行2倍倍比稀釋，作為一抗，同時將免疫前的兔血清稀釋100倍作為陰性對照，進行間接免疫熒光(indirect immunofluorescence assay,IFA)試驗。將純化的重組NP蛋白稀釋至2 μg/mL作為包被抗原，通過間接ELISA測定所制備的NP蛋白多克隆抗體效價。

2 結 果

2.1 H9N2 NP基因擴增及原核表達質粒構建

PCR擴增H9N2NP基因使其帶上酶切位點，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果顯示，PCR產物大小約1 500 bp(圖1A)，與預期大小相符。將PCR產物克隆至pMD18-T載體，與pET-32a(+)同時酶切后構建pET-32a-H9N2-NP重組質粒，菌液PCR擴增出約1 500 bp的片段，雙酶切后得到1 500和5 900 bp兩條帶，均分別與預期大小一致(圖1B)。測序結果顯示，克隆至pET-32a(+)載體的H9N2NP基因序列與原始毒株序列一致，表明原核表達質粒構建成功。

M1，DL5000 DNA Marker；1，H9N2 NP基因PCR擴增產物；2，陰性對照；3，重組質粒pET-32a-H9N2-NP；4，重組質粒pET-32a-H9N2-NP經BamH Ⅰ單酶切鑒定；5，重組質粒pET-32a-H9N2-NP經BamH Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切鑒定；M2，DL10000 DNA Marker M1，DL5000 DNA Marker；1，PCR amplification products of of H9N2 NP gene;2，Negtive control;3，The recombinant plasmid pET-32a-H9N2-NP;4，The recombinant plasmid pET-32a-H9N2-NP identified by BamH Ⅰ digestion；5，The recombinant plasmid pET-32a-H9N2-NP identified by BamH Ⅰ and Sal Ⅰ digestion;M2，DL10000 DNA Marker圖1 H9N2 NP基因擴增(A)及重組質粒酶切鑒定(B)Fig.1 PCR amplification of H9N2 NP gene (A) and enzymatic digestion identification of the recombinant plasmids (B)

2.2 NP蛋白表達的SDS-PAGE和Western blotting鑒定

將pET-32a-H9N2-NP分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受態細胞，誘導表達后菌樣進行12% SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色后顯示，誘導后的重組菌pET-32a-NP/Rosetta(DE3)在70 ku附近有一條十分明顯的條帶，與預期大小一致，而誘導后的重組菌pET-32a-NP/BL21(DE3)在相同位置也有一條很細的條帶，遠低于在大腸桿菌Rosetta(DE3)中的表達量(圖2A)。Western blotting結果表明，該蛋白能與His標簽抗體和NP蛋白抗體結合(圖2B、2C)。對重組NP蛋白的表達條件進行優化，最終確定在1 mmol/L IPTG、37 ℃條件下誘導7 h為最佳誘導條件，且目的蛋白主要以包涵體形式表達(圖3～5)。

2.3 親和層析純化與鑒定

為確保His標簽能夠徹底暴露，將包涵體蛋白超聲破碎后在變性條件下溶解，然后采用鎳柱進行親和層析純化，蛋白純化效果見圖6，純化后的蛋白較純化前雜蛋白明顯減少。

2.4 濃縮后蛋白濃度測定及Western blotting鑒定

純化后的蛋白在6、4、2、0 mol/L尿素下進行復性，然后包埋在PEG20000中進行濃縮，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測得蛋白濃度為0.2 mg/mL。Western blotting結果表明，復性濃縮后的蛋白能與His標簽抗體(圖7A)和NP蛋白抗體(圖7B)結合。

2.5 多克隆抗體驗證及抗體效價測定

分別以純化后的NP蛋白和H9N2亞型AIV病毒液作為抗原，以制備的兔多克隆抗體作為一抗，進行Western blotting檢測，所制備的兔多克隆抗體在稀釋104倍后仍能與NP蛋白和H9N2亞型AIV有效結合(圖8)。將H9N2亞型AIV接種96孔板MDCK細胞，感染24 h進行IFA試驗，以制備的兔多克隆抗體倍比稀釋后作為一抗，以免疫前兔血清作為陰性對照，陽性血清在稀釋1 600倍后還能觀察到綠色熒光(圖9)。間接ELISA測得所制備的兔多克隆抗體效價高達1∶409 600(圖10)，表明NP蛋白具有良好的免疫原性。

① A，SDS-PAGE分析；B，Western blotting分析(一抗為His標簽抗體)；C，Western blotting分析(一抗為NP抗體)。② M1，蛋白質分子質量標準；1，pET-32a(+)/Rosetta(DE3)誘導后；2，pET-32a(+)/BL21(DE3)誘導后；3，pET-32a-NP/Rosetta(DE3)誘導前；4，pET-32a-NP/Rosetta(DE3)誘導后；5，pET-32a-NP/BL21(DE3)誘導前；6，pET-32a-NP/BL21(DE3)誘導后；M2，彩色預染蛋白質分子質量標準；7，pET-32a-NP/BL21(DE3)誘導后；8，pET-32a-NP/Rosetta(DE3)誘導前；9，pET-32a-NP/Rosetta(DE3)誘導后 ① A，SDS-PAGE analysis;B，Western blotting analysis (the primary antibody is His tag antibody);C，Western blotting analysis (the primary antibody is NP antibody).② M1，Protein Marker;1，pET-32a(+) after induction in E. coli Rosetta(DE3);2，pET-32a(+) after induction in E. coli BL21(DE3);3，pET-32a-NP without induction in E. coli Rosetta(DE3);4，pET-32a-NP after induction in E. coli Rosetta(DE3);5，pET-32a-NP without induction in E. coli BL21(DE3);6，pET-32a-NP after induction in E. coli BL21(DE3);M2，Prestained Protein Marker;7，pET-32a-NP after induction in E. coli BL21(DE3);8，pET-32a-NP without induction in E. coli Rosetta(DE3);9，pET-32a-NP after induction in E. coli Rosetta(DE3)圖2 pET-32a-NP/BL21(DE3)、pET-32a-NP/Rosetta(DE3)重組蛋白SDS-PAGE及Western blotting分析Fig.2 SDS-PAGE and Western blotting analysis of the recombinant pET-32a-NP protein in E. coli BL21(DE3)and Rosetta (DE3)

M，蛋白質分子質量標準；1～8，IPTG濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol/L；9，空載體對照 M，Protein Marker;1-8，Concentrations of IPTG were 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 and 1.6 mmol/L,respectively;9，Blank vector control圖3 不同濃度IPTG誘導NP蛋白表達Fig.3 NP protein expression induced by different concentrations of IPTG

M，蛋白質分子質量標準；1～9，誘導時間分別為0、1、2、3、4、5、6、7、8 h M，Protein Marker;1-9，Induction time was 0，1，2，3，4，5，6，7 and 8 h,respectively圖4 不同時間誘導NP蛋白表達Fig.4 NP protein expression induced by different time

M，蛋白質分子質量標準；1，誘導后全菌；2，未誘導全菌；3，16 ℃誘導上清；4，16 ℃誘導沉淀；5，25 ℃誘導上清；6，25 ℃誘導沉淀；7，37 ℃誘導上清；8，37 ℃誘導沉淀 M，Protein Marker;1，Full bacteria after induction;2，Full bacteria without induction;3，Hyperacoustic supernatant when induction temperature was 16 ℃;4，Hyperacoustic precipitation when induction temperature was 16 ℃;5，Hyperacoustic supernatant when induction temperature was 25 ℃;6，Hyperacoustic precipitation when induction temperature was 25 ℃;7，Hyperacoustic supernatant when induction temperature was 37 ℃;8，Hyperacoustic precipitation when induction temperature was 37 ℃圖5 不同溫度誘導NP蛋白表達Fig.5 NP protein expression induced by different temperatures

M，預染蛋白質分子質量標準;1，純化后的重組蛋白;2，未純化重組蛋白 M，Prestained Protein Marker;1，Purified recombinant protein;2，Unpurified recombinant protein圖6 NP蛋白純化SDS-PAGE結果Fig.6 SDS-PAGE result of the purification of NP protein

①A，一抗為His標簽抗體；B，一抗為NP蛋白抗體。②M，預染蛋白質分子質量標準；1，純化后的重組蛋白；2，未純化的重組蛋白 ①A，The primary antibody is His tag antibody;B，The primary antibody is NP protein antibody. ②M，Prestained Protein Marker;1，Purified recombinant protein;2，Unpurified recombinant protein圖7 純化后重組蛋白的Western blotting鑒定Fig.7 Western blotting identification of the purified recombinant protein

M，預染蛋白質分子質量標準；1，抗原為純化后的重組蛋白；2，抗原為H9N2亞型AIV M，Prestained Protein Marker;1，The antigen is purified recombinant protein;2，The antigen is H9N2 subtype AIV圖8 NP抗血清Western blotting鑒定Fig.8 Western blotting identification of NP antiserum

圖9 NP抗血清IFA驗證(100×)Fig.9 IFA result of NP antiserum (100×)

圖10 NP抗血清抗體效價測定Fig.10 Antibody titer determination of NP antiserum

3 討 論

H9N2亞型AIV在世界范圍內廣泛傳播[18]，但其引起的臨床癥狀不夠典型，與一些其他病毒引起的癥狀相似[19]。H9N2能造成家禽的免疫抑制，導致其他呼吸道疾病的嚴重繼發感染[19-20]，臨床病理表現復雜，因此需要實驗室檢測來進行確診。HI試驗是AIV常用的血清學檢測方法，但HI試驗針對的靶蛋白是HA。HA蛋白時常為了逃避免疫而發生抗原漂移，導致標準抗體血清與流行株的交叉反應能力下降[21]，造成HI試驗的靈敏度下降。而NP蛋白具有型特異性，在不同亞型AIV間的保守度超過90%，因此常被選作為流感病毒ELISA檢測的靶蛋白。Wu等[22]建立了H9N2亞型AIV NP蛋白的ELISA檢測方法，該方法較HI試驗更加靈敏，且能夠同時檢測H1～H15亞型甲型流感病毒。因此，以NP蛋白為靶點的AIV檢測方法具有很強的應用價值。本研究對前期分離到的1株三源重組的Y280系H9N2亞型AIV進行了NP蛋白的原核表達和多克隆抗體制備，旨在為后期單克隆抗體的制備及ELISA檢測方法的建立奠定基礎。

本研究中，H9N2 NP蛋白在大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態細胞中的表達水平遠遠高于大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，與樓晶瑤[23]研究結果一致。大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態細胞較大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞補充了6種稀有密碼子，序列分析發現，BS/19 NP蛋白中大腸桿菌稀有密碼子約占20%，因此更易在大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態細胞中表達。可溶性分析結果表明，目的蛋白以包涵體沉淀的形式表達。包涵體的產生是由于蛋白在大腸桿菌中表達過快而來不及正確折疊[24-25]，后期需要經過繁瑣的變性、復性來純化并得到具有正確生物學活性的蛋白。通過降低誘導溫度能夠使目的蛋白緩慢表達以增加蛋白折疊的時間，本研究在25 ℃誘導時，破碎上清中也能檢測到目的蛋白，但大部分仍以包涵體沉淀的形式表達，且破碎上清中雜蛋白較多，不利于下游的純化工作，今后可以嘗試通過在載體上引入可溶性標簽來幫助目的蛋白的可溶性表達。

通過ELISA測得所制備的兔抗NP血清效價達到1∶409 600，表明NP蛋白具有良好的免疫原性。但本研究的免疫原為帶有His標簽的重組NP蛋白，同時ELISA試驗的包被抗原也帶有His標簽。雖然His標簽的分子質量很小，但抗體效價測定結果也可能會受到影響。Western blotting及IFA試驗結果均表明，所制備的NP抗血清能夠高效地與H9N2亞型AIV結合，且特異性良好，可作為后期AIV NP蛋白血清學鑒定的生物材料。

4 結 論

本研究利用原核表達系統成功表達了H9N2亞型AIV NP蛋白，通過鎳柱親和層析獲得了純度較高的重組蛋白。免疫新西蘭大白兔后獲得NP蛋白多克隆抗體，間接ELISA測得抗體效價為1∶409 600，NP多克隆抗體能與BS/19病毒高效結合，表明NP蛋白免疫原性良好，可作為后期試驗的生物材料。