豬圓環(huán)病毒2型和3型混合感染引起的母豬繁殖障礙診治

孫慶帥，陳燕虹，姚 倫，孫 琪，于學(xué)祥，吳 昊，阮勝男，雷銘楷，嚴(yán)偉東，何啟蓋

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院/動物醫(yī)學(xué)院,武漢 430070；2.農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室,武漢 430070；3.武漢科前生物股份有限公司，武漢 430072)

20世紀(jì)90年代中期在患有仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的豬病料中發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV2)，2016年在患有豬皮炎和腎病綜合征(porcine dermatitis and nephrotic syndrome，PDNS)的豬病料中發(fā)現(xiàn)PCV3，這2種基因型的PCV均可引起嚴(yán)重的繁殖障礙性疾病，造成母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、屢配不孕等臨床癥狀，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

PCV2自發(fā)現(xiàn)以來一直是引起豬繁殖障礙性疾病的主要病原體，可引起母豬的繁殖障礙和仔豬生長遲緩等。在PCV2發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外都有關(guān)于在流產(chǎn)胎兒和死胎的病料中檢測到PCV2核酸的報道[2-7]。2015年，在北卡羅萊納州的某個豬場發(fā)現(xiàn)了PCV3的存在，該場母豬死亡率升高、受胎率降低、流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎，臨床特征表現(xiàn)為厭食、多灶性丘疹、斑疹及淺表皮炎，經(jīng)檢測僅發(fā)現(xiàn)PCV3核酸存在[8]。Saporiti等[9]檢測53份流產(chǎn)胎兒和死胎病料中的PCV3核酸，發(fā)現(xiàn)PCV3單獨感染的樣品量為33.9%。Alomar等[10]在葡萄牙某患病豬場仔豬(4～10周齡)病料中發(fā)現(xiàn)了PCV3的核酸，且無PCV2、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)及其他病原體感染，仔豬臨床特征表現(xiàn)為生長遲緩、被毛粗糙、耳朵后傾。提示繼PCV2后，PCV3也可能成為危害養(yǎng)豬業(yè)的主要繁殖障礙性病原體。

已有研究表明，PCV2、PCV3可跨物種傳播，具有高傳播性，加大了規(guī)模化養(yǎng)殖場的防控難度[1]。2020年8月-2020年12月期間，湖北地區(qū)某存欄220頭約克夏母豬的規(guī)模化豬場出現(xiàn)受胎率和產(chǎn)仔率低的現(xiàn)象。人工授精170頭母豬，受胎率在10%左右；43頭懷孕母豬共產(chǎn)268頭健康仔豬，53頭弱仔，4頭死胎，平均每頭豬產(chǎn)仔6～7頭。為尋找該場屢配不孕、持續(xù)返情的病因，本研究通過觀察該場母豬臨床表現(xiàn)，并采集母豬的口鼻腔拭子、肛拭子、組織及飼料樣品進(jìn)行實驗室診斷，根據(jù)結(jié)果提供治療與防控策略，以期使得該豬場能恢復(fù)正常生產(chǎn)，為廣大養(yǎng)豬業(yè)防控和診治此類繁殖障礙性疾病提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 采集該場后備母豬、懷孕母豬、哺乳母豬飼料槽中的全價配合飼料；采集10頭返情母豬口鼻腔拭子、肛門拭子、前腔靜脈血液；隨機(jī)剖檢13頭返情母豬，采集脾臟、腹股溝淋巴結(jié)、脊髓等免疫系統(tǒng)組織及子宮、卵巢等生殖器官組織；采集的所有樣品均在低溫保存條件下24 h內(nèi)迅速帶回實驗室進(jìn)行檢測。

1.1.2 主要試劑及儀器 血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；Simply P 總RNA提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司；2×TaqMasterMix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；PremixTaqTM(Probe qPCR)、RNA反轉(zhuǎn)錄酶均購自TaKaRa公司；無水乙醇、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)等均購自國藥集團(tuán)化學(xué)制藥有限公司。恒溫水浴鍋購自富華儀器有限公司；勻漿振蕩儀購自QIAGEN公司；實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96TM)購自Bio-Rad公司；常溫或冷凍離心機(jī)購自Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 飼料中黃曲霉素B1檢測 將采集的全價配合飼料在湖北省飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗站按照GB/T 17480-2008方法進(jìn)行檢測。

1.2.2 病原檢測 將該場采集的母豬口鼻腔拭子、肛門拭子進(jìn)行處理后，按照試劑盒說明書提取DNA和RNA；取各母豬的脾臟、腹股溝淋巴結(jié)、脊髓、子宮、卵巢各10 mg，混合放入無酶EP管中，進(jìn)行處理后按照試劑盒說明書提取DNA和RNA；RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后使用,反轉(zhuǎn)錄體系20 μL：反轉(zhuǎn)錄酶4 μL，RNA 16 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 50 s；4 ℃ 2 min。以得到的DNA和cDNA為模板使用常規(guī)PCR進(jìn)行PCV2、PCV3、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、PRRSV、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、豬瘟病毒(Classic swine fever virus，CSFV)檢測。根據(jù)各個病毒的保守基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息見表1。各病毒檢測PCR反應(yīng)體系均為20 μL：2×TaqMasterMix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，DNA或cDNA模板3 μL，ddH2O 6.2 μL。

表1 病原檢測所用引物信息Table 1 Primer information for pathogen detection

1.2.3 各組織中病毒分布情況 在脾臟、腹股溝淋巴結(jié)、脊髓、子宮、卵巢各組織的病變和健康交界處取50 mg組織塊置于滅菌EP管中，經(jīng)處理后，用于提取DNA。使用實時熒光定量PCR檢測各組織中PCV2、PCV3病毒載量，檢測所用引物與探針信息見表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 實時熒光定量PCR引物和探針信息Table 2 Primer and probe information for Real-time quantitative PCR

1.2.4 PCV2、PCV3ORF2基因序列分析 選取部分PCV2、PCV3 PCR檢測結(jié)果為陽性的樣品DNA，進(jìn)行PCV2、PCV3ORF2基因的擴(kuò)增并測序。從GenBank中搜集國內(nèi)外PCV2、PCV3的全基因組或ORF2基因序列，使用SnapGene軟件進(jìn)行序列比對，使用Mega 11.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹 (Bootstrap 重復(fù)計算1 000次)，使用DNAStar軟件包中的MegAlign進(jìn)行核苷酸序列相似性分析。PCV2、PCV3ORF2基因擴(kuò)增引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息見表3。PCV2、PCV3全基因組或ORF2基因參考序列見表4、5。

表3 ORF2基因擴(kuò)增所用引物信息Table 3 Primer information for ORF2 gene amplification

表4 PCV2國內(nèi)外毒株參考毒株信息Table 4 Information of domestic and foreign PCV2 reference strains

續(xù)表

表5 PCV3國內(nèi)外毒株參考信息Table 5 Information of domestic and foreign PCV3 reference strains

1.2.5 卵巢病理切片觀察 采集母豬卵巢組織樣品，放入多聚甲醛中固定，按照常規(guī)方法制作石蠟切片并使用HE染色，將制作好的切片置于普通倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.6 診斷結(jié)論、防控建議及回訪 結(jié)合該場母豬臨床表現(xiàn)及實驗室病原檢測結(jié)果，確定引起該場母豬屢次返情的病因，并根據(jù)結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)的急救措施，在采取措施2個月后對該場進(jìn)行回訪調(diào)查，詢問其是否恢復(fù)生產(chǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 飼料中的黃曲霉素B1檢測

從該場采集的后備、懷孕、哺乳母豬的全價配合飼料中黃曲霉素B1的含量分別為9.0、4.5和4.5 μg/kg。GB 13078-2017規(guī)定豬用飼料中黃曲霉素B1允許量為<20 μg/kg。表明該場飼料的黃曲霉素B1含量均在允許范圍內(nèi)。

2.2 病原檢測

將處理好的樣品進(jìn)行DNA/RNA提取，使用PCR、RT-PCR方法檢測病原，結(jié)果顯示，口鼻腔拭子、肛門拭子及血清等樣品PCV2、PCV3、PPV、PRRSV、PRV、CSFV檢測結(jié)果均為陰性。母豬混合組織樣檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCV2陽性率為69.23%(9/13)，PCV3陽性率為38.46%(5/13)(表6)。13頭母豬中PCV2和PCV3混合感染率為30.76%(4/13)。PCV2和PCV3部分陽性樣品核酸電泳結(jié)果見圖1。

表6 各樣品中病原檢測結(jié)果Table 6 Pathogen detection results in each sample

M，DL2000 DNA Marker；1、2,PCV2混合組織陽性樣品;-，陰性對照；+，陽性對照；3、4,PCV3混合組織陽性樣品 M,DL2000 DNA Marker;1 and 2,PCV2 positive samples;-，Negative control;+，Positive control；3 and 4,PCV3 positive samples圖1 PCV2(A)和PCV3(B)部分樣品PCR結(jié)果電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR results of some samples of PCV2 (A) and PCV3 (B)

2.3 各組織中病毒分布情況

實時熒光定量PCR方法檢測各組織中PCV2、PCV3載量結(jié)果顯示，PCV2在脊髓中的病毒載量最高，脾臟次之，淋巴結(jié)中最少；PCV3在脾臟中病毒載量最高，脊髓次之，卵巢中載量最少(表7)。

2.4 PCV2、PCV3 ORF2基因序列分析

由圖2、3可知，本次測序的3個PCV2陽性樣品(分別為QJ/HB/CN/201、QJ/HB/CN/202和QJ/HB/CN/203)均為PCV2d亞型，與國內(nèi)的2009SD株(KX904945.1)、SXYLA-05株(KC800642.1)、JX0801株(GQ359009.1)、SDld02M株(HM755880.1)、M/2010株(JF927988.1)、HBwh-24株(FJ870971.1)等毒株屬于同一分支，親緣關(guān)系較近，核苷酸序列相似性在99.1%～99.9%之間；與比利時的ii11a株(EU909686.1)、國內(nèi)的09SX123株(HQ395044.1)、GXWM株(EF675241.1)等處于不同分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，核苷酸序列的相似性在97.8%左右；與其他亞型的PCV2毒株核苷酸序列相似性在89.0%～94.4%之間。

表7 各組織中PCV2、PCV3病毒載量Table 7 Viral load in each tissue 拷貝/μL

圖2 PCV2 ORF2基因遺傳進(jìn)化分析Fig.2 Genetic evolution analysis of PCV2 ORF2 gene

由圖4、5可知，PCV3陽性樣品均為PCV3a亞型(分別為QJ/HB/CN/204、QJ/HB/CN/205和QJ/HB/CN/206)，與國內(nèi)PCV3-CN-HLG-2株(MH277108.1)、QHD1株(MT711857.1)、JX-2/CH/2017株(MF677839.1)屬于同一分支，親緣關(guān)系較近，核苷酸序列相似性在99.5%～100%之間；與同是PCV3a亞型的國內(nèi)PCV3-CN-HLJ-2018株(MK178315.1)、PCV3/CN/GX/GX12/2018株(MN788149.1)、PCV3-CN2018HLG-5株(MH277111.1)、CN/Hubei-610/2016株(KY354038.1)、PCV3-CN-JL28-2018株(MK178315.1)、LN56株(MK347416.1)及美國KSU-MO-2017-PCV3-45株(MH603550.1)、韓國PCV3/KU-1601株(KY996337.1)處于不同分支，核苷酸序列相似性在98.9%～99.5%之間；與PCV3b亞型的毒株核苷酸相似性在97.3%～98.9%之間。

圖3 PCV2 ORF2基因核苷酸序列相似性分析Fig.3 Nucleotide sequence similarity analysis of PCV2 ORF2 gene

圖4 PCV3 ORF2基因遺傳進(jìn)化分析Fig.4 Genetic evolution analysis of PCV3 ORF2 gene

圖5 PCV3 ORF2基因核苷酸序列相似性分析Fig.5 Nucleotide sequence similarity analysis of PCV3 ORF2 gene

本次測序PCV2、PCV3陽性樣品所得序列均已提交NCBI，登錄號分別為：OM964855、OM964856和OM964857，以及OM964858、OM964859和OM964860。

2.5 卵巢病理切片觀察

卵巢病理切片HE染色整體結(jié)果顯示,卵泡細(xì)胞數(shù)量減少；卵母細(xì)胞細(xì)胞核皺縮、變形，發(fā)育不正常；次級生長卵泡形態(tài)呈梭形，顆粒細(xì)胞數(shù)量減少，顆粒細(xì)胞膜和卵泡腔變形；初級生長卵泡透明帶瓦解，會導(dǎo)致無法正常排卵；有中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。觀察單獨感染PCV2、單獨感染PCV3及PCV2和PCV3混合感染的母豬卵巢組織，都有瘀血的病理現(xiàn)象發(fā)生，且卵泡腔發(fā)育不規(guī)則甚至塌陷、扁平。部分卵巢病理切片見圖6。

2.6 診斷結(jié)論、防控建議及回訪結(jié)果

根據(jù)該豬場臨床癥狀和實驗室檢測結(jié)果綜合診斷，確定該豬場配種失敗持續(xù)返情、生產(chǎn)效益低下為PCV2和PCV3混合感染所致。

對全群進(jìn)行PCV2疫苗接種，同時，對豬場內(nèi)外環(huán)境徹底消毒，由原來的3 d一次消毒增加到每天2次，加強(qiáng)通風(fēng)，控制好濕度與溫度，改善飼養(yǎng)環(huán)境，盡量減少豬的應(yīng)激反應(yīng)。

2個月后對其回訪，豬場內(nèi)現(xiàn)有約克夏母豬200頭，受胎率均達(dá)到90%以上，仔豬也無顫抖的臨床癥狀發(fā)生。

3 討 論

繁殖障礙性疾病對養(yǎng)豬業(yè)危害極大，是日常生產(chǎn)中較為常見的一類疾病。母豬在日常飼喂過程中不會有明顯的異常表現(xiàn)，但在母豬配種時會表現(xiàn)出多次發(fā)情、配種多次而無法懷孕的現(xiàn)象，在妊娠過程中發(fā)生流產(chǎn)，所產(chǎn)仔豬體弱多病或為畸形[11-12]，增加了規(guī)模化豬場的飼養(yǎng)壓力，減少了經(jīng)濟(jì)效益。在本案例中，母豬外觀與表現(xiàn)均無明顯的異常情況，卻表現(xiàn)出多次發(fā)情、屢配不孕、妊娠母豬產(chǎn)仔率低下等情況，為典型的繁殖障礙表現(xiàn)。

黃曲霉素B1是目前發(fā)現(xiàn)的最豐富的毒菌霉素，主要生物學(xué)效應(yīng)是致癌性、免疫抑制、導(dǎo)致突變、飼料效率低、肝臟受損等，會導(dǎo)致母豬不孕、流產(chǎn)等情況[13-14]。中國及歐盟規(guī)定豬飼料中最高黃曲霉素B1的含量為20 μg/kg，從該場所帶回的飼料檢測結(jié)果顯示黃曲霉素B1的含量符合國家標(biāo)準(zhǔn)，說明并非因飼料儲存不當(dāng)導(dǎo)致飼料發(fā)霉變質(zhì)，引起黃曲霉素B1超標(biāo)而導(dǎo)致的母豬屢配不孕。

PCV可感染各個日齡的豬，可經(jīng)過垂直傳播或者水平傳播，會導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)震顫、多系統(tǒng)衰竭、消瘦，母豬不孕、流產(chǎn)等癥狀。本研究在豬的口腔、鼻腔、肛門拭子及血清中均未檢測到可引起豬繁殖障礙的病毒核酸存在，如PRV、PRRSV等。通過進(jìn)一步的對該場母豬進(jìn)行解剖，眼觀可發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)腫大。經(jīng)檢測，在該場母豬的脾臟、淋巴結(jié)、脊髓、子宮及卵巢中均發(fā)現(xiàn)PCV2、PCV3核酸，表明引起該場繁殖障礙的原因為感染PCV2和PCV3。本研究還發(fā)現(xiàn)PCV2和PCV3的病毒載量均在免疫系統(tǒng)中(脾臟和脊髓)較高，因此，在檢測PCV2、PCV3時可優(yōu)先選擇采集脊髓和脾臟等免疫系統(tǒng)組織。薛霜等[15]檢測豬的各個組織中的PCV3核酸，發(fā)現(xiàn)其在脾臟、淋巴結(jié)和肺臟中病毒含量最高，與本研究結(jié)果相符。

衣殼蛋白(Cap蛋白)是PCV主要的結(jié)構(gòu)蛋白，決定毒株的免疫原性。對該場所檢測到的部分PCV2、PCV3陽性樣品擴(kuò)增ORF2基因，基于ORF2基因與國內(nèi)外的參考序列進(jìn)行比對，分析其遺傳進(jìn)化以及核苷酸序列相似性。結(jié)果表明本研究中測序的3個PCV2陽性樣品均為PCV2d亞型，本次PCV3測序的3個陽性樣品均為PCV3a亞型，通過分析國內(nèi)外PCV3參考毒株序列的ORF2基因，發(fā)現(xiàn)本研究測序的3個PCV3陽性樣品與國內(nèi)地區(qū)多個毒株相似性為100%，整體在97.3%～99.9%之間。Ku等[16]對國內(nèi)的33株P(guān)CV3進(jìn)行ORF2基因序列分析發(fā)現(xiàn)，其與國內(nèi)外參考毒株核苷酸相似性在98.4%～100%之間；李蕊等[17]對國內(nèi)12株P(guān)CV3進(jìn)行ORF2基因序列分析發(fā)現(xiàn)，其所獲得的PCV3與國內(nèi)外多個參考毒株的核苷酸相似性為100%；郭影成等[18]對所獲得4株P(guān)CV3進(jìn)行ORF2基因核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn)，其核苷酸相似性在97.7%～99.7%之間；這些結(jié)果都表明目前PCV3的遺傳變異較小，與本研究結(jié)果一致。

目前關(guān)于PCV2和PCV3感染母豬后母豬卵巢的病理變化情況相關(guān)研究甚少。雌性動物懷孕的前提是其卵子的正常排出，卵巢是卵泡從開始發(fā)育到排卵的場所，為雌性哺乳動物的重要生殖腺器官[19]。本研究中，卵巢表現(xiàn)為卵泡細(xì)胞數(shù)量少，原始卵泡發(fā)育不正常，卵母細(xì)胞細(xì)胞核皺縮，卵泡腔發(fā)育不規(guī)則、塌陷扁平，并存在中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤而引起的炎癥現(xiàn)象，具有散在出血點和淤血。表明母豬感染PCV2和PCV3后可造成卵泡發(fā)育不良，導(dǎo)致其無法排卵，最終造成母豬在配種時出現(xiàn)屢配不孕的現(xiàn)象。

PCV的傳播途徑十分廣泛，當(dāng)豬群中有豬感染了PCV時，帶毒豬在群內(nèi)走動，就會傳播病毒，且飼養(yǎng)員與攜帶病毒的豬接觸后，飼養(yǎng)員的設(shè)備或衣服也可變成病毒傳播的一種媒介。當(dāng)母豬在妊娠時期感染了PCV，其所產(chǎn)仔豬可能會通過胎盤垂直傳播的方式，在出生時就攜帶PCV。目前PCV2已有滅活疫苗和亞單位疫苗，可預(yù)防PCV2所帶來的相關(guān)臨床癥狀。自2012年以后，PCV2d基因亞型已逐漸替代PCV2b基因亞型，成為主流的PCV2基因亞型。國內(nèi)外均有研究表明，PCV2a或PCV2b疫苗均可為PCV2d提供一定的交叉免疫保護(hù)力[20-22]。本研究中，確診該場繁殖障礙母豬為感染PCV2、PCV3所致，該豬場母豬在接種PCV2b疫苗后，成功控制疫情，使得該場成功恢復(fù)了生產(chǎn)。提示PCV2的控制對PCV3可能也起到一定的控制作用。在豬場日常管理中，為預(yù)防各種繁殖障礙性疾病的感染，應(yīng)當(dāng)對常見病毒如PCV、PRRSV、PRV等設(shè)定相應(yīng)的免疫程序，在不同的免疫日齡使用一致的基因型疫苗，避免病毒的重組。此外，要做好生物安全防控，嚴(yán)格控制車流、物流、人員流動等，做好消毒防護(hù)措施；不同圈舍各自準(zhǔn)備一套衣服，圈舍門口也應(yīng)準(zhǔn)備消毒腳盆、酒精燈等進(jìn)行充分消毒，把病毒傳播的幾率降到最低，做好生物安全防控，加大對繁殖障礙性疾病的防控[23]。

4 結(jié) 論

通過對臨床癥狀的判斷，結(jié)合實驗室檢測結(jié)果，最終判定該場母豬屢配不孕的原因為感染PCV2、PCV3。對部分PCV2、PCV3陽性樣品進(jìn)行ORF2基因序列分析，得知該場感染PCV2為2d亞型，PCV3為3a亞型,全群接種PCV2疫苗，加強(qiáng)生物安全防控，2021年4月對其回訪，該豬場已成功恢復(fù)生產(chǎn)。本研究結(jié)果為規(guī)模化養(yǎng)殖場在防控或診治繁殖障礙類疾病提供借鑒。