恩諾沙星新鹽的制備、表征及溶解性研究

王凱茹，毛雅楠，徐瑞濤，趙興華，何 欣

(河北農業大學動物醫學院，保定 071000)

恩諾沙星(enrofloxacin，ENR)，又名恩氟沙星，是一種動物專用的氟喹諾酮類抗菌藥物，具有抗菌譜廣、殺菌力強的特點[1-2]，它可以選擇性地抑制微生物細胞的DNA促旋酶(一種Ⅱ型拓撲異構酶)和拓撲異構酶Ⅳ，導致細菌死亡[3-4]。在臨床應用中，ENR可以治療禽類、豬、牛等的尿路、呼吸道、腸道以及皮膚和組織等感染[5]；目前也廣泛應用于水產養殖中，主要用于細菌性疾病和支原體感染的治療[6]。ENR在中性溶液中溶解度較差(0.45 mg/mL)[5]，其在體內溶解后從胃排空到腸內時可能發生重結晶，導致腸內容物中ENR濃度較低[7]，這種特性限制了恩諾沙星制劑的開發和應用。藥物成鹽/共晶是指藥物活性成分(active pharmaceutical ingredient，API)和共形成物按照一定的化學計量比以離子鍵或非共價鍵結合而成的晶體，若API與共形成物之間未發生質子轉移形成共晶，發生質子轉移則形成鹽[8-9]。大量文獻研究表明，鹽/共晶可有效提高藥物活性成分的溶解度、滲透性、穩定性及生物利用度等[10-12]。為有效提高ENR的溶解度，本研究利用晶體工程技術制備ENR新鹽，并對新鹽進行表征和體外溶解速率研究，以期為提高ENR生物利用度及擴大臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

ENR(純度≥98%)、2,6-二羥基苯甲酸(2,6-dihydroxybenzoic acid，2,6-DHBA，純度≥98%)均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ENR標準品(純度≥98%)購自北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇(分析純)購自福晨(天津)化學試劑有限公司。

粉末X射線衍射儀(D8 Advance)、光譜儀(Alpha FT-IR)均購自BRUKER公司；單晶X射線衍射儀(Agilent Gemini E)購自Rigaku公司；掃描電子顯微鏡(MERLIN Compact)購自Carl Zeiss公司；差式掃描量熱儀(DCS 3)購自METTLER TOLEDO公司；熱重分析儀(TGA-209 F3)購自NETZSCH公司；高效液相色譜儀、檢測器、色譜柱(SunFire C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)均購自Waters公司；單磁力攪拌器(CCLH BASIC)購自上海小聰科技有限公司。

1.2 ENR新鹽的制備

稱取ENR(53.91 mg，0.15 mmol)和2,6-DHBA(23.12 mg，0.15 mmol)于10 mL離心管中，加入1 mL 50%乙醇，室溫下250 r/min攪拌24 h，過濾，40 ℃烘干，過100目篩備用。

1.3 ENR新鹽的單晶培養

采用溶劑揮發法制備單晶：稱取ENR(35.94 mg,0.1 mmol)和2,6-DHBA (15.41 mg,0.1 mmol)于10 mL離心管中，加入3 mL 50%乙醇，250 r/min攪拌12 h，之后用微孔濾膜過濾，濾液置于通風櫥中靜置，使緩慢生長單晶。

1.4 表征分析

1.4.1 單晶X射線衍射(SXRD) 使用單晶X射線衍射儀進行數據采集，將大小合適的單晶從溶劑中轉移到單晶衍射儀的冷氣流中，測試溫度為110.7 K，測試光源為Mo Kα射線(λ=0.71073 ?)，采集的單晶數據使用CrysAlisPRO程序進行晶胞確定和數據還原，結構用Olex2程序解析并精修，通過Mercury 4.2.0軟件繪制晶體結構。

1.4.2 粉末X射線衍射(PXRD) 使用粉末X射線衍射儀進行數據采集，將少量(3～5 mg)的藥物粉末平鋪于樣品板，測定條件為：Cu Kα (λ=1.5418 ?)光源，電壓40 kV，電流40 mA，步長為0.02°/步，測試速度為0.1 s/步，樣品掃描范圍為3°～35°。收集后的數據使用Origin Pro 2017軟件作圖分析。

1.4.3 傅里葉紅外光譜(FTIR) 使用光譜儀進行測定，將粉末樣品分別與溴化鉀混合，取適量混合粉末于瑪瑙研缽中，充分研磨混勻，壓片制樣進行掃描測試，采集范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.4.4 熱分析 差示掃描量熱分析(DSC)：使用差式掃描量熱儀進行數據收集，稱取3～5 mg樣品粉末，置于Mettler DSC標準鋁盤中，將鋁盤蓋扎2個小孔蓋到鋁盤上壓緊。測定溫度范圍為25～350 ℃，升溫速度為10 K/min，氮氣流速為50 mL/min。

熱失重分析(TGA)：使用熱重分析儀進行數據收集，取約5 mg粉末樣品置于鋁坩堝內，蓋上鋁蓋，測定溫度范圍為25～350 ℃，升溫速度為10 K/min，氮氣流速為50 mL/min。

1.4.5 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察 使用掃描電子顯微鏡觀察并拍攝樣品的形貌照片，工作電壓為20 kV，將樣品用雙面膠帶固定在銅板上，并用金噴射，觀察樣品形貌。

1.5 ENR新鹽的溶解速率及溶解度考察

1.5.1 高效液相色譜(HPLC)測定方法 流動相為乙腈∶0.025 mol/L磷酸水溶液(三乙胺調節pH至2.5±0.1)=18∶82(V/V)，流速為1.0 mL/min，柱溫為37 ℃，檢測波長為278 nm，進樣量為20 μL。

1.5.2 標準曲線的繪制 精密稱取ENR標準品5 mg，使用0.1 mol/L NaOH溶液溶解并定容，配制成含1 mg/mL ENR的標準母液。精密量取標準母液適量，用流動相稀釋得到ENR濃度為80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625及0.3125 μg/mL的待測溶液，使用0.22 μm過濾器過濾后采用HPLC系統進行測定。以ENR濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，得到回歸方程，繪制出ENR的標準曲線。

1.5.3 ENR新鹽的溶解速率及溶解度測定 對過篩后的ENR和ENR-2,6-DHBA·1/2H2O進行粉末溶出測定。以pH 6.8的磷酸鹽緩沖液為溶出介質，將過量的ENR和ENR-2,6-DHBA·1/2H2O分別加入到溶出介質中，設置攪拌器速度為250 r/min，溫度為37 ℃，在預設的2、5、10、15、20、30、45、60、120、240、360、480 min取200 μL溶液，立即過濾同時補充等體積新鮮介質，使用流動相稀釋到合適倍數后進行HPLC的測定，試驗平行3次，并在溶出試驗結束后收集濾渣測定PXRD。

2 結 果

2.1 SXRD分析

培養單晶的濾液在揮發1周左右長出了透明棒狀的晶體，晶體學數據顯示ENR-2,6-DHBA·1/2H2O鹽屬于三斜晶系的P-1空間群，晶胞參數為：a=13.2495(7) ?；b=13.8266(11) ?；c=16.0672(8) ?；α=114.301°(6)；β=90.322°(4)；γ=114.438°(7)。表1中提供了主要氫鍵的鍵距和鍵角。根據收集到的數據繪制ENR-2,6-DHBA·1/2H2O的晶體結構，結果顯示，ENR-2,6-DHBA·1/2H2O的不對稱單元中包含2個ENR陽離子、2個2,6-DHBA陰離子和1個水分子(圖1A)；ENR分子內形成O5-H5…O6 (2.580 ?)氫鍵，2,6-DHBA羧酸基團上的質子轉移到了ENR哌嗪環的N原子上，通過N6+-H6…O11-(2.685 ?)和N3+-H3…O7-(2.693 ?)相互作用，其中1個ENR與H2O形成O15-H15A…O1 (2.763 ?)氫鍵，相鄰的2組不對稱單元通過2個水分子之間的O15-H15…O15 (2.921 ?)氫鍵連接成十聚體結構(圖1B)；相鄰十聚體以短接觸作用形成1個無限的1D鏈，1D鏈通過短接觸作用形成2D層(圖1C)；2D層通過短接觸作用、范德華力等形成3D結構(圖1D)。

表1 ENR-2,6-DHBA·1/2H2O的氫鍵參數Table 1 Hydrogen bonding distance and angles for ENR-2,6-DHBA·1/2H2O

續表

A，不對稱單元；B，十聚體；C，二維結構；D，三維結構 A，Asymmetric unit；B，Decamer；C，2D structure；D，3D structure圖1 ENR-2,6-DHBA·1/2H2O晶體結構Fig.1 Crystal structure of ENR-2,6-DHBA·1/2H2O

2.2 PXRD分析

ENR的PXRD圖譜中在衍射角度為6.9°、8.4°、9.5°、14.3°、14.7°、17.1°處具有特征峰，2,6-DHBA在7.7°、11.9°、14.4°、25.1°、27.2°有特征峰，而ENR-2,6-DHBA·1/2H2O的圖譜上原料藥的特征峰消失，并在6.1°、8.7°、10.7°、12.9°、17.5°、19.5°、26.0°、26.8°、27.9°處出現新的特征峰(圖2)，形成物的衍射峰與初始物質均不同，證實了新物質的形成[13]。此外，試驗制得的ENR-2,6-DHBA·1/2H2O的PXRD圖譜與SXRD數據模擬的圖譜一致，進一步證實了新物質與培養的單晶相同。

圖2 ENR、2,6-DHBA、ENR-2,6-DHBA·1/2H2O及模擬的ENR-2,6-DHBA·1/2H2O的PXRD圖譜Fig.2 PXRD diagram of ENR,2,6-DHBA,ENR-2,6-DHBA·1/2H2O and simulated ENR-2,6-DHBA·1/2H2O

2.3 FTIR分析

ENR、2,6-DHBA和ENR-2,6-DHBA·1/2H2O的FTIR結果見圖3。由圖3可知，ENR在1 736和1 628 cm-1處的吸收峰是羧基和吡啶酮環中的C=O的伸縮振動峰；2,6-DHBA在1 680 cm-1處的吸收峰是羧基中C=O的伸縮振動峰，在3 470 cm-1處的吸收峰是羧基中-OH的伸縮振動峰。形成鹽后，2,6-DHBA中1 680 cm-1處C=O的吸收峰向高波數移動到1 725 cm-1，表明2,6-DHBA羧基的質子轉移到ENR哌嗪環的N原子上。ENR-2,6-DHBA·1/2H2O紅外光譜中3 450 cm-1處出現的寬頻帶是水分子中-OH的伸縮振動峰[14]。

圖3 ENR、2,6-DHBA和ENR-2,6-DHBA·1/2H2O的FTIR圖譜Fig.3 FTIR spectra of ENR,2,6-DHBA and ENR-2,6-DHBA·1/2H2O

2.4 熱分析

ENR、2,6-DHBA和ENR-2,6-DHBA·1/2H2O的DSC、TGA結果見圖4。由圖4可知，ENR在224 ℃時出現明顯的吸熱峰，這是ENR的熔點峰，在290 ℃時出現熱失重，這與TGA結果相吻合；ENR-2,6-DHBA·1/2H2O在51 ℃開始出現1個小的吸熱峰，且TGA圖中在51 ℃出現第1個熱失重過程，約失重1.68%，經計算，ENR-2,6-DHBA·1/2H2O分子中的1/2H2O占總分子質量的1.72%，證實此失重對應晶體結構中存在的半分子水；DSC中在253 ℃開始出現吸熱峰，對應其熔點，TGA圖中在251 ℃出現第2個失重過程，失重約30%，經計算ENR-2,6-DHBA·1/2H2O分子中2,6-DHBA占總分子質量的30%，因此該失重對應2,6-DHBA的分解；295 ℃出現第3個失重為ENR的失重過程。

圖4 ENR、2,6-DHBA和ENR-2,6-DHBA·1/2H2O的DSC(A)及TGA(B)曲線Fig.4 DSC (A) and TGA (B) curves of ENR,2,6-DHBA and ENR-2,6-DHBA·1/2H2O

2.5 SEM觀察

ENR形貌呈現為棱角分明的長條塊狀(圖5A)，2,6-DHBA呈現出無規則的碎塊狀或碎條狀(圖5B)，而ENR-2,6-DHBA·1/2H2O是表面光滑的棒狀(圖5C)?？梢娭苽涞男蔓}形貌不同于ENR和2,6-DHBA。

2.6 標準曲線的繪制

使用高效液相色譜對ENR待測液進行測定，在5.45 min有樣品峰(圖6)，測得峰面積值后，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線(圖7)，回歸方程為：y=―30 678.32+165 472.57x，R2=0.9998，在0.3125～80 μg/mL濃度范圍內線性良好。

圖6 ENR標準品液相色譜圖Fig.6 Liquid chromatogram of ENR standard

圖7 HPLC測定ENR的標準曲線Fig.7 Standard curve of ENR of HPLC determination

2.7 溶解速率及溶解度測定

ENR和ENR-2,6-DHBA·1/2H2O在37 ℃、pH 6.8磷酸緩沖液中的粉末溶出結果顯示，ENR原料藥在20 min時濃度達到0.67 mg/mL，隨后濃度開始下降，6 h后降至0.35 mg/mL，達到平衡(圖8)。對溶出試驗后的固體粉末進行PXRD檢測發現，ENR在溶出后發生轉變，在水溶液中會轉變成溶解度更低的ENR·6H2O[15]；ENR-2,6-DHBA·1/2H2O鹽在溶出1 h后表觀溶解度為0.65 mg/mL，直至8 h濃度依然保持穩定，此時溶解度是ENR的1.86倍，對溶出后的殘渣進行PXRD檢測發現，ENR-2,6-DHBA·1/2H2O在溶出介質中沒有發生轉變(圖9)。說明ENR-2,6-DHBA·1/2H2O在水溶液中具有較好的穩定性。

圖8 ENR和ENR-2,6-DHBA·1/2H2O的粉末溶出曲線Fig.8 Powder dissolution curves of ENR and ENR-2,6-DHBA·1/2H2O

圖9 ENR和ENR-2,6-DHBA·1/2H2O試驗后殘渣的PXRD圖譜Fig.9 PXRD diagram of ENR and ENR-2,6-DHBA·1/2H2O after experiment

3 討 論

ENR是化學合成的抗菌藥物，殺菌作用強，進入機體后易被組織吸收，在體內分布廣泛[16]。但ENR在中性水溶液中溶解度較低，低水溶性極大地限制其新型制劑的開發，另外，ENR屬于濃度依賴性抗菌藥物[17]，在臨床使用時為了達到治療所需血藥濃度，通常會投入較大的使用劑量，會增大毒副作用。藥物成鹽是指在適宜的溶劑中藥物活性成分與帶有相反電荷的組分均電離，然后兩者以離子鍵相結合，以鹽的形式結晶析出的過程[18-19]。將藥物活性成分和一種共形成物制備成鹽可以解決藥物溶解度低的問題[20]。

3.1 ENR新鹽的晶體結構與表征

本研究以ENR為藥物活性成分，2,6-二羥基苯甲酸為共形成物，采用混懸法制備了一種ENR新鹽。PXRD圖譜顯示了舊峰的消失和新峰的出現，證實新物質的生成。單晶結構解析可對晶體的晶型進行鑒別，確定晶體結構中原子、分子、離子在三維空間的排布規律[21]，經單晶結構解析可知該新物質ENR-2,6-DHBA·1/2H2O，屬于三斜晶系P-1空間群，結構中ENR、2,6-DHBA和H2O的比例為2∶2∶1，由于存在質子的轉移，因此制備的新物質是一種鹽。

FTIR具有靈敏度高、光譜范圍廣和分辨率高等優點[22]，已廣泛用于共晶、鹽、溶劑化物/水合物的鑒定以及區分單組分和多組分晶體的不同多晶型[23]。在FTIR中，當有分子間相互作用時，相關官能團的伸縮振動峰會發生偏移。Wang等[24]制備了阿司匹林-川芎嗪藥物-藥物共晶，FTIR結果顯示該共晶中阿司匹林在3 487.04 cm-1處羧基中-OH的伸縮振動峰以及川芎嗪在1 411.34 cm-1處對應哌嗪C=N的伸縮振動峰均消失了，這與阿司匹林和川芎嗪之間形成分子間氫鍵(O-H…N)有關。本研究制備的新鹽由于質子的轉移(形成N+-H…O-)導致2,6-DHBA羧基中C=O在1 680 cm-1處的吸收峰偏移到了1 725 cm-1處。

熱性質是評估固態藥物物理化學轉變過程(如形成過程、多態轉變和分解)的參數[25]，方法通常包括TGA和DSC。通過控制溫度的升降，測定藥物粉末隨溫度變化而產生的理化性質方面的改變，如脫水、升華、熔化、氧化、分解及晶型轉變，也可以作為檢測鹽/共晶純度的一個輔助手段。周凱等[26]制備了黃連素-染料木素有機鹽水合物，晶體結構中包含水分子和乙醇分子，在TGA分析中，有機鹽水合物在30～150 ℃失去10%的質量，這與水和乙醇分子總質量分數(10.1%)相吻合，且在DSC圖中，該水合物在30～150 ℃出現了1個較寬的吸熱峰，對應著失去水和乙醇的過程。本研究中，ENR-2,6-DHBA·1/2H2O的TGA圖中在100 ℃之前出現了1個小的失重，約為1.68%，對應晶體結構中的半個水分子(經計算約為總質量分數的1.72%)，且在DSC圖中也出現了1個寬而小的吸熱峰，對應了水分子的蒸發。

3.2 ENR新鹽的溶出速率及溶解度

固態藥物的表觀溶解度和溶出度對藥物開發和質量控制至關重要[27]。藥物鹽/共晶是提高難溶性藥物溶解度、溶出速率的有效方法，其機制有兩種，首先，晶體晶格能的降低可引起溶解度的增加；其次，具有更好親水性的共形成物更有可能增加所得鹽/共晶的溶劑親和力[28-29]。坎地沙坦是一種水溶性差的藥物[30]，Srivastava等[31]將坎地沙坦和對羥基苯甲酸甲酯制備成共晶，采用搖瓶法測定溶解度，坎地沙坦的溶解度為2.03 mg/mL，而共晶的溶解度為14.12 mg/mL，表明坎地沙坦形成共晶后溶解度提高了約6倍。在溶解度研究后對得到的固體粉末干燥并進行PXRD測定，固體粉末的衍射峰與試驗前沒有發生變化，表明它在48 h后仍是穩定的。ENR在溶出20 min時濃度達到0.67 mg/mL，但隨后的時間點濃度逐漸下降，降至0.35 mg/mL達到平衡，根據溶出曲線的變化推測ENR在溶出過程中可能發生了轉變，收集8 h溶出后的固體粉末測定PXRD發現衍射峰發生了變化，溶出后的物質與ENR·6H2O的PXRD衍射峰吻合，判斷ENR在溶出介質中接觸水之后轉變成了溶解度更低的ENR·6H2O。而ENR-2,6-DHBA·1/2H2O在溶出1 h后達到平衡沒有出現濃度下降的情況，此時的表觀溶解度為0.65 mg/mL，是ENR的1.86倍，通過對溶出后的固體粉末測定PXRD發現，ENR-2,6-DHBA·1/2H2O溶出前后沒有發生變化，證明該鹽在水中是穩定的。

4 結 論

試驗利用晶體工程技術，采用混懸法制備了ENR-2,6-DHBA·1/2H2O新鹽，通過溶劑揮發法培養了單晶，晶體結構顯示ENR-2,6-DHBA·1/2H2O屬于三斜晶系，P-1空間群，ENR與2,6-DHBA通過N+-H…O-相互作用。新鹽的外貌形態呈光滑的棒狀，熔點為253 ℃。平衡時的表觀溶解度是ENR的1.86倍，說明ENR-2,6-DHBA·1/2H2O可提高ENR的溶解性。