陽離子脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物對K562 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的作用機(jī)制

王保全 陳江濤 申智慧 周黎明 李文倩 史朝輝 翟巧玲 張永州

1.河南大學(xué)淮河醫(yī)院藥學(xué)部，河南開封 475004；2.河南大學(xué)淮河醫(yī)院普外科，河南開封 475004；3.河南省腫瘤醫(yī)院血液科，河南鄭州 450009；4.河南大學(xué)鄭州頤和醫(yī)院藥學(xué)部，河南鄭州 450047

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是指細(xì)胞在發(fā)展進(jìn)程中高度保守的、由雙鏈RNA（doublestranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源信使RNA（messenger RNA，mRNA）高效特異性降解的現(xiàn)象。其作為基因治療的一種新模式，始終是當(dāng)前腫瘤防治研究的熱點(diǎn)話題，在治療上，RNAi 通過遞送小RNA 雙鏈結(jié)合體，包括內(nèi)源性微RNA、外源性干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA），短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）等實(shí)現(xiàn)基因干預(yù)效應(yīng)。但siRNA 進(jìn)入人體后易被人類血清中的核糖核酸酶家族降解，且由于siRNA 自身電荷特異性難以進(jìn)入正常細(xì)胞內(nèi)，所以對siRNA 遞送體系的研究是將siRNA 應(yīng)用于臨床治療的一大挑戰(zhàn)。基因載體主要分為病毒載體和非病毒載體。病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率高，但對人體毒性過大影響其臨床應(yīng)用；非病毒載體可填補(bǔ)病毒載體的部分不足，近年來備受重視。如脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因組轉(zhuǎn)化與病毒載體比較，優(yōu)勢凸顯。陽離子脂質(zhì)體攜帶的正電荷可中和siRNA 帶有的負(fù)電荷，形成具有緊密結(jié)構(gòu)的復(fù)合物，極大地延長循環(huán)時(shí)間，促進(jìn)siRNA 遞送。本研究以K562 細(xì)胞為研究對象，選擇陽離子磷脂、硫酸魚精蛋白、小牛胸腺DNA，制備新型陽離子脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合體，觀察其對K562 細(xì)胞生長的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

1,2 二油酰基-3-三甲基氨基丙烷（美國Sigma公司），膽固醇、小牛胸腺DNA、瓊脂糖（上海生物工程有限公司），DNA-Marker（上海生物工程有限公司），吖啶橙（美國Sigma 公司），反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（大連寶生物公司），胎牛血清（美國Introgen 公司），RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司），二甲亞砜（DMSO，上海生物工程有限公司），MTT 細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑盒（杭州碧云天公司），聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國Bio 公司），JEM-4000透射電子顯微鏡（日本島津公司），F(xiàn)TS-3000 傅里葉紅外光譜儀（美國戴爾公司），其他試劑均為分析純，根據(jù)bcr/ablmRNA 堿基序列5′-AAGCGUUC AAGCUUCAGCGGCAGGUA-3′設(shè)計(jì)siRNA；所有序列和引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

K562 細(xì)胞（購自河南省腫瘤醫(yī)院）在含100ml/L胎牛血清、100U/L 青霉素、100mg/L 鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，放置于37℃、50ml/L CO的培養(yǎng)箱中傳代，每隔3～5d 傳代1 次，取對數(shù)期細(xì)胞以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）調(diào)整濃度至2×10/L 進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 方法

1.3.1 空白脂質(zhì)體的制備 采用逆向蒸發(fā)法制備，將磷脂與膽固醇（摩爾比3∶1，2∶1，1∶1）置于25ml 茄形瓶中，超聲溶入5ml 氯仿，旋蒸15min（水浴25℃，壓力0.06MPa）形成均勻的分散膜，加入5ml HO，置于旋蒸儀上旋蒸水合50min（水浴50℃，常壓），超聲5min，過0.45/0.22μm 濾膜，以HEPES和100mmol/L NaCl 稀釋后備用。

1.3.2 脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物的制備、表征 混合小牛胸腺細(xì)胞DNA 和siRNA，添加不同配比的硫酸魚精蛋白（按siRNA 與小牛胸腺質(zhì)量比為1∶0.5～2.1），再添加空白脂質(zhì)體（按siRNA 與磷脂比值為1∶100～1000），室溫下孵育15～20min，孵育后的脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物固定在碳支持膜上，以負(fù)染劑（20ml/L 磷鎢酸）洗染約20min，使用JEM-4000EX透射電鏡觀察脂質(zhì)體復(fù)合物形態(tài)。

1.3.3 脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物對K562 細(xì)胞生長的抑制作用 取對數(shù)生長期K562 細(xì)胞，以2×10/L 的密度接種于96 孔板上，每孔接種2×10個(gè)細(xì)胞，放置于37℃、500ml/L CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h 后，分別加入100、150、200、250、300μmol/L 的脂質(zhì)體-siRNA復(fù)合物，以不加任何藥物的K562 細(xì)胞混懸液為對照組，并設(shè)有調(diào)零孔（只含RPMI-1640 培養(yǎng)液），每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，持續(xù)培育24、48 和72h 后，每孔加入20μl MTT 試劑，在培育箱中持續(xù)培育4h 后，棄去培養(yǎng)液，加入二甲亞砜200μl，搖床上震蕩10min，將酶標(biāo)儀調(diào)零，測定值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率=（1-處理組值/對照組值）×100%，重復(fù)測量3 次取平均值。

1.3.4 脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物在K562 細(xì)胞中表達(dá)的熒光顯微鏡觀察 實(shí)驗(yàn)另設(shè)空白對照組、單siRNA 組、Lipofectamine+siRNA 組、脂質(zhì)體+siRNA 組和脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物組（siRNA 以熒光標(biāo)記），將各遞送系統(tǒng)與K562 細(xì)胞孵育12h 后從培養(yǎng)箱中取出，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS 洗滌，40ml/L 多聚甲醛固定45min，PBS 再洗滌，加入20mg/L 的PI 染色液30min后以PBS 洗滌，加蓋玻片以甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5 脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物對K562 細(xì)胞凋亡的影響 收集K562 細(xì)胞和脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物處理48h 后的K562 細(xì)胞，700ml/L 乙醇4℃固定過夜，預(yù)冷PBS 洗滌細(xì)胞3 次，加1g/L 核糖核酸酶A 200μl，37℃孵育30min，加入100μg/l 碘化丙啶染色液800μL，混勻，4℃避光靜置30min 后進(jìn)行檢測，上流式細(xì)胞儀測定DNA 水平，分析細(xì)胞周期分布直方圖。

1.3.6 K562 細(xì)胞bcl-2、bax、caspase-3 蛋白表達(dá)的檢測 將K562 細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期且細(xì)胞密度為80%時(shí)，將脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物加入不同的培養(yǎng)皿中，并將最終濃度調(diào)整為100、150、200、250、300μmol/L。培養(yǎng)48h 后，在4℃下離心15min，收集細(xì)胞，添加細(xì)胞裂解液以收集總細(xì)胞蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，制備100g/L SDS-PAGE 凝膠電泳2.0～2.5h。膜轉(zhuǎn)移2h后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，用50g/L TBST制備的脫脂乳密封1h。滴加一抗bcl-2、bax（1∶200稀釋）、caspase-3（1∶1000 稀釋），4℃孵育過夜，隨后回收一抗并以TBST 洗滌膜3 次，每次5min。使用ECL 超敏溶液進(jìn)行發(fā)光顯影，用GAPDH 檢測作為內(nèi)部參考。ImageJ 軟件分析目標(biāo)蛋白和內(nèi)部參考蛋白的灰度值，蛋白質(zhì)相對表達(dá)=目標(biāo)灰度值/內(nèi)部參考灰度值。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測K562 細(xì)胞內(nèi)mRNA的表達(dá) 采用一步法提取細(xì)胞總RNA。瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA 質(zhì)量，分光光度計(jì)測定RNA 濃度。根據(jù)試劑盒的操作進(jìn)行cDNA 逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測bcl-2、bax 和caspase-3 基因表達(dá)，用MGB 標(biāo)記bcl-2、bax 和caspase-3 基因，用FAM 標(biāo)記GAPDH 基因，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性2min，再變性15s，復(fù)性60s，共40 個(gè)周期，每次設(shè)置多個(gè)試管作為陰性對照，以GAPDH 為內(nèi)標(biāo)，10g/L 瓊脂糖凝聚電泳后，通過GIS 數(shù)字凝膠圖像處理系統(tǒng)獲得PCR 產(chǎn)物的吸光度值，以各組bcl-2、bax 和caspase-3的值/GAPDH 的值表示各mRNA 表達(dá)水平，各引物和探針序列見表1。

表1 相關(guān)因子引物及引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合體對K562 細(xì)胞的生長抑制作用

MTT 法檢測結(jié)果顯示，不同濃度的脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物對K562 細(xì)胞均具有抑制作用，濃度為100、150、200、250、300μmol/L 的脂質(zhì)體-siRNA復(fù)合物作用48h 后對K562 細(xì)胞的抑制率分別為（21.10±3.55）%、（35.32±5.21）%、（63.89±5.61）%、（90.54±8.51）%和（85.75±4.79）%，濃度為250μmol/L 的脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物對K562 細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)（＜0.05），見圖1。

圖1 脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物對K562 細(xì)胞的生長抑制作用

2.2 脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物對K562 細(xì)胞周期的影響

固定脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物濃度為250μmol/L（實(shí)驗(yàn)組），實(shí)驗(yàn)組的G期細(xì)胞顯著多于對照組（＜0.05），S 期和G/M 期細(xì)胞顯著少于對照組（＜0.05），見表2。

表2 兩組細(xì)胞周期分布比較（，%）

2.3 熒光顯微鏡觀察siRNA 的入胞效果

熒光顯微鏡觀察FAM標(biāo)記siRNA各組遞送系統(tǒng)轉(zhuǎn)染K562 細(xì)胞12h 后入胞效能，結(jié)果顯示，單siRNA組具有一定的入胞效能，但遠(yuǎn)低于其他各組入胞效能，小牛胸腺DNA 和魚精蛋白可顯著提高siRNA 入胞效能，且新型脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物具備較大的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能力（＜0.05），見圖2。

圖2 各組脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物熒光顯微鏡觀察結(jié)果（FAM 熒光標(biāo)記，×200）

2.4 脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物對bcl-2、bax 和capase-3 mRNA 表達(dá)的影響

脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物在轉(zhuǎn)染K562 細(xì)胞后48h，隨著復(fù)合物濃度的增加，K562 細(xì)胞bcl-2 mRNA 表達(dá)水平顯著下降，bax、caspase-3 mRNA 表達(dá)水平顯著升高（＜0.05），其中脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物濃度為250μmol/L 時(shí)，bcl-2、bax 和caspase-3 mRNA 表達(dá)水平變化最為顯著，見圖3。

圖3 脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物對bcl-2、bax 和capase-3 mRNA 表達(dá)水平的影響

2.5 脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物對bcl-2、bax 和caspase-3蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，脂質(zhì)體-siRNA 復(fù)合物轉(zhuǎn)染K562 細(xì)胞48h 后，對細(xì)胞內(nèi)bcl-2、bax和caspase-3 蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)不同程度的影響，隨著復(fù)合物濃度的增加，bcl-2 蛋白表達(dá)水平逐漸下降，bax、caspase-3 蛋白表達(dá)水平逐漸增加（＜0.05），見圖4。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測bcl-2、bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平

3 討論

慢性粒細(xì)胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）是一類造血干細(xì)胞異常的克隆性疾病，bcr-abl融合基因的異常表達(dá)是其顯著特征。研究顯示，bcr-abl 基因是由9 號(hào)染色體上abl 與22 號(hào)染色體上bcr 相互易位形成的融合基因，該基因編碼的BCR-ABL 融合蛋白具有較強(qiáng)的酪氨酸激酶活性，可通過多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。伊馬替尼是首個(gè)用于臨床的選擇性酪氨酸激酶抑制劑，可大大提高CML 患者的生存率，然而長期用藥后患者會(huì)出現(xiàn)耐藥情況。因此，在酪氨酸激酶抑制劑治療的基礎(chǔ)上，尋找新的治療策略意義重大。

siRNA 作為基因治療的一種新模式，始終是當(dāng)前腫瘤防治研究的熱點(diǎn)。siRNA 長約21nt，且3’端有兩個(gè)堿基凸出，可解決反義核酸技術(shù)治療難題。但裸siRNA 進(jìn)入人體后易被核糖核酸酶降解，因此，選擇合適的載體就顯得十分重要，陽離子脂質(zhì)體作為DNA、RNA 載體常用于基因治療，研究發(fā)現(xiàn)，陽離子脂質(zhì)體與腫瘤新生血管內(nèi)皮上帶負(fù)電荷的蛋白聚糖、磷脂、過唾液酸化和過糖基化膜蛋白發(fā)生靜電作用，從而形成被動(dòng)靶向作用。Khan 等研究顯示，以脂肪酸合成酶為靶點(diǎn)，通過使用人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）抗體修飾的脂質(zhì)體包裹siRNA 可抑制HER-2 陽性乳腺癌細(xì)胞增殖。Atu027 是一種由陽離子脂質(zhì)體AtuFECT01 介導(dǎo)的siRNA 釋放的脂質(zhì)體釋放系統(tǒng)，可抑制蛋白激酶N3 在血管內(nèi)皮中的表達(dá)，減輕腫瘤炎性反應(yīng)，在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，陽離子脂質(zhì)體能使藥物在腫瘤部位富集，抑制腫瘤組織生長，從而延長動(dòng)物生存時(shí)間，降低腫瘤藥物毒性。本研究采用轉(zhuǎn)染性較強(qiáng)的陽離子脂質(zhì)體，設(shè)計(jì)針對K562 細(xì)胞中特異的bcr-abl 基因siRNA 并體外化學(xué)合成，用陽離子脂質(zhì)體包裹siRNA，體外轉(zhuǎn)染CML K562 細(xì)胞，與商品化轉(zhuǎn)染試劑相比較，取得良好的實(shí)驗(yàn)效果，為新藥研發(fā)及臨床治療、預(yù)防CML 提供了一個(gè)新的研究方向。