缺氧誘導因子在小腸缺血再灌注損傷中的研究進展

圖拉妮薩·喀迪爾 羅杰 廖師師 孟慶濤

武漢大學人民醫院麻醉科，湖北武漢 430060

小腸缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是由小腸扭轉、絞窄型腸梗阻、急性腸系膜缺血、小腸移植、潛在失血性休克、嚴重創傷、敗血癥等引起的外科急癥。IRI 時可引起一系列病理生理變化，如自由基生成增多、膜脂質過氧化、細胞內鈣超載、線粒體通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）打開、線粒體分裂、細胞結構破壞等，這些病理生理過程導致腸黏膜屏障受損致使細菌和內毒素從消化道入血，刺激中性粒細胞、巨噬細胞釋放大量炎性介質和氧化因子，形成炎癥風暴，引起全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），甚至引起多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），最終死亡。缺氧時，缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）作為轉錄因子，通過調控血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）、糖酵解酶、葡萄糖轉運蛋白和其他靶基因的表達以恢復血液循環，促進血管生成和血管重構，減輕炎性反應，調控能量代謝以改善組織氧合和細胞在低氧環境中的生存，從而發揮促進細胞存活、對抗炎癥、抑制凋亡的保護作用。HIF-1α 對保護腸道免受IRI 至關重要。因此，調控HIF-1α 及其下游靶基因的表達有助于減輕缺血性損傷。本文針對HIF-1α 在IRI 中的作用及相關機制進行綜述。

1 缺氧誘導因子轉錄因子家族

1.1 HIF 結構

HIF 是堿性螺旋-環-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）蛋白轉錄因子超家族的成員，由氧敏感的α-亞基（HIF-α）和組成性表達的β-亞基（HIF-β）組成。缺氧調節的亞基HIF-α 在哺乳動物中存在三種亞型（HIF-1α，HIF-2α 和HIF-3α）。組成性表達的β 亞基（HIF-1β，HIF-2β 和HIF-3β）不受氧含量的影響。HIF-1α 幾乎存在于所有的細胞內，其表達受到氧狀態的調控，而HIF-1β 基本上是持續表達，HIF-1α 與HIF-1β 結合形成二聚體后發揮生物學功能。

1.2 HIF 表達調控及功能

HIF 的穩定和轉錄受2-氧戊二酸依賴的雙加氧酶家族調控，該家族包括脯氨酸羥化酶（proline hydroxylase domain，PHD）和天冬酰胺羥化酶即缺氧誘導因子抑制因子（factor inhibiting HIF，FIH）。在正常氧濃度條件下，PHD 利用氧、2-氧戊二酸、鐵（Fe）和抗壞血酸作為輔助因子，在脯氨酸殘基上羥基化HIF-1α，羥基化的HIF-1α 被腫瘤抑制因子復合物蛋白酶體降解。

除了受PHD 的負調節外，HIF 的激活還受FIH調控。與PHD 類似，FIH 也能感知氧濃度的變化，促使C-TAD 處的HIF-1 天冬酰胺803 殘基羥基化，并阻止其與轉錄輔助激活因子cbp/p300 結合，降低HIF 的轉錄活性。

在缺氧條件下，氧氣在線粒體氧化磷酸化過程中被消耗，使PHD 活性降低，FIH 的催化活性也受到抑制，促使HIF-α 在胞質中積累，并轉運到細胞核，與HIF-1β 二聚。HIF-α 與HIF-1β 在細胞核二聚化后形成復合體，該復合體與cbp/p300 共激活因子相互作用，與啟動子區域中缺氧反應元件結合，并激活基因轉錄。受HIF 調控的缺氧細胞通過轉錄和轉錄后調控機制適應缺氧，對抗應激。

作為缺氧適應的關鍵調節因子，HIF 以組織特異性的方式調節500 多個具有多種生物學功能的人類基因，如VEGF、EPO、內皮素、熱激蛋白90、一氧化氮合酶、凋亡/細胞周期阻滯等基因。缺氧條件下，HIF 優先誘導糖酵解酶和丙酮酸脫氫酶表達，從而減輕缺氧給組織帶來的損傷，促進血管生成，組織修復再生，其與活性氧（reactive oxygen species，ROS）之間有密切而復雜的聯系，除此之外HIF 與免疫、炎癥、代謝性疾病、缺血性疾病也有緊密聯系。

2 小腸缺血再灌注損傷與缺氧誘導因子

2.1 HIF 在小腸IRI 中的抗氧化作用

IRI 發生在器官的血液供應中斷（缺血），然后重新建立血供（再灌注）時，導致線粒體ROS 的“暴發”。在缺血期間，能量代謝從脂肪酸氧化轉換到糖酵解，使組織維持細胞活力的時間延長。再灌注過程中，線粒體不僅產生高水平的ROS，影響DNA 氧化并誘導促凋亡途徑，且打開MPTP，進一步促進ROS 生成，形成惡性循環，稱為ROS 誘導ROS 釋放（ROS-induced ROS release，RIRR）?？赏ㄟ^恢復pH 和鈣超載來維持MPTP 的狀態，但其會增加溶質的滲透性，導致線粒體膜電位的崩潰和破壞。RIRR的破壞作用協同增加缺血后的氧化應激。

腸道是食物消化和吸收的主要場所，其主要依賴基底外側的Na/K-ATP 酶的驅動作用，因此腸上皮具有較高的能量需求，對血流減少也很敏感。當發生腸缺血時，首先影響絨毛尖端和結腸表面的上皮細胞。隨著缺血持續時間的延長，小腸絨毛尖端腸腔的細胞和結腸隱窩表面上皮最先失去與基底膜的連接，并逐漸喪失向隱窩基底延伸的細胞。長時間的缺血，促使錨定在一起的緊密連接破裂，導致上皮細胞從基底膜中分離出來，進入腸腔。腸道缺血性損傷后，再灌注誘導氧氣流入，從而導致ROS過度產生。IRI 通過激活腸上皮細胞、多形核中性粒細胞、巨噬細胞誘導炎性反應，進一步促進ROS 產生，使炎癥進一步惡化。由此可見腸IRI 過程中多種反應均可引起ROS 的產生，選擇性地減弱與疾病相關的ROS 形成已成為IRI 治療的一個研究熱點。

2019年諾貝爾獎獲得者Gregg L.Semenza詳細描述了HIF 在缺氧條件下維持氧化還原穩態的機制。HIF-1 通過調節乙酰輔酶A 合成抑制ROS 的產生，缺氧條件下，HIF 通過激活丙酮酸脫氫酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1)和乳酸脫氫酶A（lactic acid dehydrogenase A，LDHA），將丙酮酸轉化為乳酸，阻止丙酮酸向乙酰輔酶A 的轉化。HIF-1 還可通過降低脂肪酸氧化，從而減少乙酰輔酶A 的合成。

HIF 通過調節線粒體蛋白和自噬來抑制ROS 的產生。缺氧條件下HIF-1 誘導Bcl-2/腺病毒E1B19kDa相關蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B19kD interacting protein 3，BNIP3）和編碼微RNA（microRNA，miR）的基因表達，BNIP3 與Beclin-1 競爭性結合Bcl-2，釋放Beclin-1 誘導線粒體自噬。作為代謝適應性反應，線粒體自噬促進細胞在長期缺氧條件下的存活，從而減少線粒體ROS 的產生和細胞凋亡。

HIF 通過調節缺氧細胞的抗氧化防御抑制ROS的產生。在缺氧條件下，HIF 增加葡萄糖到絲氨酸的轉化和線粒體還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的產生，將谷胱甘肽從氧化形式轉化為還原形式以防止電子傳遞鏈產生的ROS 增加。

由于ROS 的生成在IRI 的發病機制中起重要作用，抗氧化已成為缺血性疾病治療的首要目標。ROS作為IRI 的關鍵分子靶點，值得深入研究。

2.2 HIF 與炎癥

缺血再灌注時中性粒細胞、肥大細胞和巨噬細胞被激活，并聚集到缺血缺氧的組織部位釋放多種介質[腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1），血管緊張素Ⅱ，血小板活化因子和白三烯-4]促進白細胞和內皮細胞黏附，黏附的白細胞遷移到組織中破壞微血管屏障，導致細胞水腫，甚至凋亡。白細胞與內皮細胞的黏附是缺血再灌注引起組織損傷和功能障礙的早期跡象，可導致微血管并發癥和組織損傷。

在炎癥的刺激下，HIF 通路被激活并通過多種途徑發揮抗炎作用。研究表明，核因子κB（nuclear factor Kappa B，NF-κB）是在缺氧條件下HIF-1α 表達的直接調節劑。長時間缺血產生的ROS 激活NF-κB 通路，導致HIF-1α 基因啟動子和HIF-1α mRNA 增加。NF-κB 也可以直接上調HIF-1β，促進HIF-1α 與HIF-1β 二聚發揮生物學功能。

缺氧和炎癥導致NF-κB 和CCAAT/增強子結合蛋白δ 活性增加，該蛋白與HIF-1α 啟動子結合并調節HIF-1α 信號傳導，從而促進炎性細胞浸潤和炎性細胞因子分泌。炎性細胞因子還可通過P38 絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK）和磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）磷酸化上調HIF-1α。此外，炎性細胞因子TNF-α誘導VHL-HIF-1α 相互作用，并通過NF-κB 依賴性途徑增加HIF-1α 積累。反之，HIF-1α 通過觸發NF-κB 相關的細胞炎癥和抑制細胞凋亡來增強嗜中性粒細胞存活。

HIF 也可通過調節Bcl-2 家族基因，與p53 相互作用，靶向線粒體酶抑制炎癥以減少細胞死亡。因此，炎癥和缺氧之間的相互作用在感染、無菌炎癥、缺血性損傷中具有重要意義。

2.3 HIF 與能量代謝

缺氧和三羧酸循環中間產物會抑制PHD 活性，從而穩定HIF 蛋白活性，促使蛋白與共激活因子發生相互作用，誘導靶基因轉錄。HIF 通過參與糖酵解、脂肪酸氧化、線粒體和過氧化物酶體代謝在能量代謝中發揮重要作用。

在低氧條件下，細胞通過誘導參與能量代謝基因的表達來適應缺氧應激。低氧時，HIF 復合物與DNA 結合以啟動HIF 靶基因的轉錄。這些轉錄產物減少氧化磷酸化，促進糖酵解從而影響線粒體代謝。低氧也可以通過調節三羧酸循環中間產物（如α-酮戊二酸和琥珀酸）的濃度直接影響線粒體代謝。除了在三羧酸循環中的作用外，琥珀酸還作為α-酮戊二酸依賴性PHD 羥基化反應的副產物調節PHD 活性和HIF 穩定性。

在缺氧期間，由于電子傳遞鏈中斷，氧化還原狀態受到干擾，也會產生ROS，HIF-1α 通過限制三羧酸循環和上調線粒體蛋白PDK1 和BNIP3 以減輕ROS 對細胞的毒性。

2.4 HIF 與miR 之間的關系

miR 是非蛋白質編碼RNA 分子，通過與信使RNA 的3′UTR 結合以控制信使RNA 的穩定性和翻譯，從而降低蛋白質水平。缺氧相關miR 在細胞凋亡、炎癥和氧化應激中具有關鍵作用。HIF 結合位點位于缺氧相關miR 啟動子區域，通過調節缺氧反應基因和缺氧相關miR 調節基因表達。

缺血再灌注誘導腸道miR 表達水平發生改變，提示miR 在IRI 的發生、發展過程中具有重要作用。miR 表達變化與潛在IRI 中的氧化應激、細胞凋亡、自噬、炎癥和上皮屏障功能障礙密切相關。一方面，在IRI 后一些miR 上調。如miR-146 上調可減少各細胞系中Toll 樣受體4（Toll-like receptor，TLR4）、白細胞介素-1 受體相關激酶（interleukin-1 receptor associated kinase，IRAK），顯著降低上皮細胞凋亡和組織損傷。當腸上皮細胞缺氧時，TLR4 和IRAK 表達上調，導致固有免疫反應激活，NF-κB 活性增強，促進炎癥因子釋放及細胞凋亡，而miR-146 可以降低TLR4 水平并減少IRAK 積累，減少細胞凋亡和組織損傷，減輕免疫反應，從而保護腸上皮細胞免于凋亡。IRI 時miR-21、miR-351、miR-381、miR-6682、miR-34a 等多種miR 上調超過2 倍。這些上調的miR通過多種途徑影響氧化應激、細胞凋亡和引起炎癥。另一方面，多種miR 在IRI 后下調。如miR-29b-3p表達水平在體內和體外IRI 后均降低，促進腫瘤壞死因子受體相關因子3（tumor necrosis factor receptorassociated factor 3，TRAF3）表達，激活轉化生長因子-α 活化激酶1 磷酸化，從而增加NF-κB、IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平以促進炎癥，同時BAX 表達上調，Bcl-2 表達下調觸發細胞凋亡，進一步促進腸損傷。miR 的研究為開發預防和治療IRI 的創新藥物提供一種新思路。

3 小腸IRI中缺氧誘導因子的治療靶點及作用

鑒于HIF 的多效性，考慮利用HIF 治療IRI 是非常有前途的一種方法。目前，HIF 激活劑主要用于正常氧濃度下穩定HIF 表達。

HIF-1 抑制劑分為直接抑制劑和間接抑制劑。直接抑制劑更具特異性，可直接影響HIF-1α/HIF-1β二聚化、HIF-1α/DNA 結合、HIF-1α-p300 相互作用或與其他重要蛋白質的相互作用。但直接抑制劑一般為肽類，不能口服使用，且代謝不太穩定，故而不適用于臨床。間接抑制劑通過與其他靶點的直接相互作用影響HIF-1α 翻譯、穩定和降解。目前使用的大多數小分子HIF-1α 抑制劑是間接抑制劑。

3.1 HIF 在缺血預處理中的應用

缺血預處理是指在組織長時間缺血前對其進行短暫、重復的缺血和再灌注，是一種內源性的對器官隨后出現持續性缺血損傷的保護措施。HIF-1α 通過誘導CD73 表達、增加腺苷和腺苷A2b 受體水平，可模擬缺血預處理的作用。目前正在進行臨床試驗的化合物中，大多數是通過小分子脯氨酸羥化酶抑制劑（prolyl hydroxylase inhibitor，PHI）抑制二甲基乙二?；拾彼幔╠imethyloxalylglycine，DMOG）依賴的羥化酶家族活性來調節HIF 的誘導和積累，即在缺血前給予DMOG 類似物激活HIF 通路，增強間充質干細胞促血管新生能力，并防止隨后缺血發作造成的組織損傷。

3.2 HIF 在缺血后處理中的應用

多項研究表明HIF 在缺血后處理中也有一定作用。在臨床實際中，各種缺血性疾病難以預測，患者多在缺血發作期間來院就診，因此，與缺血預處理相比，缺血后處理更具有臨床價值。在缺血后給予DMOG 類似物可保護組織免受缺血損傷，其機制與減少ROS 形成、抑制caspase-3 活性、激活EPO和VEGF，從而增加毛細血管密度，減輕缺血性損傷有關，可改善患者預后。有趣的是，一種臨床上常用的吸入麻醉劑七氟醚，可通過增加HIF1-α 和減少caspase-3，而起到缺血后處理的作用。

3.3 HIF-1α 與腸IRI 的其他研究

隨著對IRI 相關機制和HIF-1α 及其下游基因的不斷研究，除以上提到DMOG 類似物外，還有其他PHI 被廣泛用作PHD 抑制劑和HIF 激活劑，如鐵離子螯合劑去鐵胺可激活離體細胞和體內的HIF；醋酸酯對PHD-2 的高親和力可應用于急性缺血性模型。PHI GSK360A 可穩定HIF-1，增加HIF-1 靶基因PDK1和己糖激酶Ⅱ表達，并將細胞代謝重新編程為有氧糖酵解，從而減少IRI 期間ROS 生成和MPTP 開放。然而，大多數PHI 可抑制2-氧戊二酸依賴的雙加氧酶，但對HIF、PHD 卻是非選擇性的。因此，開發針對HIF、PHD 的特異性PHI 有待進一步研究。

此外，在預處理治療中，低水平的氧化劑可能有一定保護作用，但高水平的ROS 則被認為是有害的，可導致細胞凋亡。雖然ROS 在IRI 中起重要作用，但抗氧化療法不能預防相關疾病。因此，在不改變生理性ROS 的條件下，開發選擇性地減弱與疾病相關ROS形成的抗氧化劑可對ROS介導的組織損傷和炎癥有所幫助。

4 總結與展望

細胞在缺血缺氧情況下的適應性反應的潛在機制十分復雜，HIF 作為氧敏感轉錄激活因子發揮重要作用。HIF 在IRI 時與炎癥、氧化應激、能量代謝、細胞凋亡、上皮細胞屏障功能障礙、轉錄調控存在相關性，缺氧靶向低氧信號通路在小腸IRI 中具有治療潛力，為HIF 治療IRI 提供了新的機會。針對HIF靶向治療缺血性疾病已有一定的進展，深入研究其在疾病病理生理學及其與缺氧信號轉導關系，對缺血相關疾病的預防和治療具有重大意義。