鐵死亡調(diào)控骨質(zhì)疏松癥和骨肉瘤的研究進展

張志敏 梅其杰 延偉偉 青恒臻 岳 星 戴 易 段 戡

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西南寧 530000；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)創(chuàng)傷骨科，廣西南寧 530023

人體的骨骼細胞始終處于代謝平衡狀態(tài)，一旦失衡，就會出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥、骨肉瘤等骨代謝異常性疾病。骨質(zhì)疏松癥是由成骨細胞介導(dǎo)的骨形成減少和破骨細胞驅(qū)動的骨破壞增加的一種骨代謝失常疾病，其顯著特征為全身骨量減少。據(jù)報道，骨質(zhì)疏松癥在全球范圍內(nèi)發(fā)病人數(shù)已超2 億，且發(fā)病率隨年齡增長而增加，在我國50 歲以上人群中骨質(zhì)疏松癥的患病率約為19.2%，而65 歲以上人群則高達32.0%。同時，由于患病人數(shù)的增多，相應(yīng)的骨折風(fēng)險及殘疾問題也凸現(xiàn)出來，使其成為重大公共衛(wèi)生問題。骨肉瘤作為另一種骨代謝疾病，常見于兒童和青少年，約占全球兒童和青少年癌癥的2.4%。惡性程度高和易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是骨肉瘤的主要臨床特征，且其發(fā)病部位常包含豐富的血管，一旦發(fā)病，可通過細胞快速增殖和轉(zhuǎn)移，對人體侵害性極強，約35%的患者將面臨截肢風(fēng)險。然而對于骨質(zhì)疏松癥與骨肉瘤，目前尚無治愈之法。因此，迫切需要新的有效療法來改善骨質(zhì)疏松癥及骨肉瘤患者的治療現(xiàn)狀。

鐵死亡作為一種新定義的細胞死亡形式，與骨質(zhì)疏松癥及骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。它的發(fā)生機制涉及鐵代謝、脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和輔酶Q10 的生物合成等多種生物學(xué)過程，并對破骨細胞及骨肉瘤細胞有著重要的調(diào)控作用。從細胞角度去探尋此兩種疾病的發(fā)生機制意義重大。因此，本文就國內(nèi)外最新研究進展作一綜述，有望為骨質(zhì)疏松癥及骨肉瘤的預(yù)防、藥理研究和靶向治療等提供新依據(jù)。

1 鐵死亡概述

鐵死亡是一種不同于細胞焦亡、壞死、自噬和壞死性凋亡等的新型細胞死亡方式，2012 年由Dixon等首次發(fā)現(xiàn)并提出。鐵死亡主要以胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)的活性受到抑制、GSH 合成減少及谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的失活為主要特征。在形態(tài)上，鐵死亡以線粒體變化為主，主要表現(xiàn)為膜密度濃縮，外膜破裂，體積變小，線粒體嵴減少或消失；在生化特征上，主要體現(xiàn)為大量鐵積累和脂質(zhì)過氧化，其過程還涉及還原型GSH、GPX4 或維生素E 等內(nèi)源性鐵死亡抑制劑的耗竭與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）氧化酶的增加；從基因遺傳學(xué)角度看，鐵死亡是一個多基因調(diào)控的生物學(xué)過程，主要涉及鐵代謝、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝異常等多方面的基因表達異常。簡而言之，其發(fā)生的核心機制是高度依賴鐵的脂質(zhì)過氧化。

2 鐵死亡的調(diào)節(jié)機制

2.1 鐵代謝

在人體中，經(jīng)小腸吸收或衰老紅細胞降解形成的Fe被銅藍蛋白氧化成Fe后，繼而與轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，Tf）結(jié)合形成Tf-Fe復(fù)合體。隨后Tf-Fe復(fù)合體經(jīng)由轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 1（transferrin receptor 1，TfR1）的介導(dǎo)通過膜蛋白進入細胞內(nèi)，定位于核內(nèi)體。此過程完成后細胞核內(nèi)的Fe被前列腺跨膜上皮抗原3 的鐵還原酶還原成Fe，并在二價金屬轉(zhuǎn)運蛋白1 介導(dǎo)下從核內(nèi)體進入細胞質(zhì)中的不穩(wěn)定鐵池（labile iron pool，LIP），經(jīng)不斷堆積，最終過量的Fe被鐵轉(zhuǎn)運蛋白（ferroportin，F(xiàn)PN）氧化儲存在鐵蛋白中。如此循環(huán)往復(fù)的代謝過程嚴格控制著細胞中的鐵穩(wěn)態(tài)。鐵調(diào)素作為一種由肝臟產(chǎn)生的肽激素，在鐵穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，可與體內(nèi)儲存的FPN 相結(jié)合導(dǎo)致內(nèi)化和水解，從而減少FPN 介導(dǎo)的細胞內(nèi)鐵向細胞外的輸出，致使細胞內(nèi)鐵含量過高。體內(nèi)Fe吸收的增高或輸出減少都將引起細胞內(nèi)Fe的增加，F(xiàn)e與過氧化氫（HO）發(fā)生芬頓（fenton）反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，造成氧化還原反應(yīng)失衡，產(chǎn)生大量脂質(zhì)活性氧（reactive oxygen species，ROS），進而誘導(dǎo)細胞鐵死亡發(fā)生。

此外，核受體輔助激活因子4 作為貨物受體介導(dǎo)鐵蛋白靶向轉(zhuǎn)運至溶酶體并進行自噬性降解，釋放游離鐵至LIP 中，進而增加細胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵水平，使細胞內(nèi)的ROS 迅速積累，促進鐵死亡出現(xiàn)。同時，鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白2 是鐵代謝的主要調(diào)節(jié)因子，沉默該基因可特異性地減弱erastin 誘導(dǎo)的鐵死亡。另外，核轉(zhuǎn)錄因子紅系2 相關(guān)因子2、熱休克蛋白β1、鐵硫域蛋白1、金屬硫蛋白-1G 等蛋白作為負調(diào)節(jié)因子，能夠直接或間接進行鐵代謝調(diào)節(jié)，影響脂質(zhì)過氧化，進而調(diào)控細胞對鐵死亡的敏感度。由此可見，循環(huán)中鐵的攝取、釋放及轉(zhuǎn)運對鐵死亡有著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。

2.2 GPX4 代謝

GPX4 是一種抗氧化酶，可淬滅磷脂氫過氧化物，將膜脂氫過氧化物還原為無毒脂質(zhì)醇，在此過程中發(fā)揮重要的抗氧化作用。通過間接和直接滅活兩種形式敲低GPX4 的活性，可造成細胞抗過氧化能力下降，脂質(zhì)ROS 堆積，最終誘發(fā)細胞鐵死亡。Yang 等在研究中發(fā)現(xiàn)胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)可影響氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運，進而降低細胞內(nèi)GSH 含量并間接引起GPX4 失活，誘發(fā)細胞鐵死亡。而Shintoku 等及Eaton 等分別發(fā)現(xiàn)小分子化合物RSL3 和ML162 均可通過其親電子氯乙酰胺部分與GPX4 的硒代半胱氨酸殘基共價結(jié)合，從而以不可逆方式直接抑制過氧化物酶的催化活性，導(dǎo)致細胞鐵死亡。此外，Woo 等在實驗中還揭示altretamine作為一種新的GPX4 抑制劑，不會降低細胞內(nèi)GSH水平，而是直接降低GPX4 活性，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，最終致鐵死亡發(fā)生。因此，調(diào)節(jié)GPX4 的活性在保護細胞免受脂質(zhì)過氧化和鐵死亡方面非常重要。同時，它也被發(fā)現(xiàn)是減少復(fù)雜的脂質(zhì)過氧化氫唯一的哺乳動物蛋白質(zhì)。

2.3 脂質(zhì)過氧化代謝

脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的標(biāo)志之一，由脂質(zhì)代謝的復(fù)雜過程引起，是指氧化劑攻擊多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）等脂質(zhì)的碳碳雙鍵過程。據(jù)報道，PUFA 對脂質(zhì)過氧化有高度敏感度，并被認為是發(fā)生鐵死亡的先決條件。研究表明，脂質(zhì)代謝相關(guān)基因溶血磷脂酰膽堿酰基轉(zhuǎn)移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）和酰基輔酶A 合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）是抑制鐵死亡不可或缺的重要基因。而花生四烯酸（arachidonic acid，AA）被視為鐵死亡中最常消耗的PUFA，常作為ACSL4 的主要底物，通過在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的氧合中心產(chǎn)生氧化磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）促進鐵死亡。

ACSL4 催化AA 或腎上腺素酸（adrenic acid，AdA）的連接以產(chǎn)生AA 或AdA 酰基輔酶A 衍生物。隨后這些衍生物被LPCAT3 酯化成PE 形成AA-PE和AdA-PE，最后被15-脂肪氧化酶（15-lipoxygenase，15-LOX）氧化生成脂質(zhì)氫過氧化物，從而執(zhí)行鐵死亡脂質(zhì)信號傳導(dǎo)。此過程進一步受磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白1 調(diào)節(jié)，其與15-LOX 相互作用并激活對PUFA-PE 的催化能力，從而發(fā)生細胞鐵死亡。反之，通過使ACSL4 基因失活，能抑制脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生，在一定程度上預(yù)防鐵死亡出現(xiàn)。所以，ACSL4被確定為對鐵死亡敏感的關(guān)鍵決定因素。

3 鐵死亡在骨相關(guān)疾病中的調(diào)控作用

3.1 鐵死亡與骨質(zhì)疏松癥

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的全身性骨骼疾病，可增加骨脆性和骨折風(fēng)險。其發(fā)病常與激素失衡、營養(yǎng)因素及遺傳因素等相關(guān)聯(lián)。鐵死亡的顯著特征包含鐵過載及ROS 的增加，這兩方面可影響骨質(zhì)疏松癥的病情進展。

3.1.1 鐵過載 鐵過載是指機體鐵離子蓄積過多導(dǎo)致的一種嚴重病理狀態(tài)。研究表明機體鐵過載是引發(fā)骨質(zhì)疏松的獨立危險因素。Liu 等在用檸檬酸鐵銨（ferric ammonium citrate，F(xiàn)AC）干預(yù)行卵巢切除術(shù)的雌性大鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，F(xiàn)AC組可加速卵巢切除大鼠的骨質(zhì)流失并降低骨密度和骨小梁的數(shù)量，進而促進骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。此外，在臨床觀察中也發(fā)現(xiàn)鐵過載可誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松出現(xiàn)。過多的鐵積累使得絕經(jīng)后女性更易引發(fā)骨質(zhì)疏松，在50 歲以上女性中約有一半患有骨質(zhì)疏松癥，這是由于絕經(jīng)后女性的血清鐵蛋白水平升至絕經(jīng)前的2～3 倍。因此，抑制鐵過載可能有助于維持機體的鐵穩(wěn)態(tài)平衡，并對預(yù)防骨質(zhì)疏松癥及降低患病率具有重要意義。

3.1.2 ROS 的增加 ROS 主要來源于線粒體，線粒體電子轉(zhuǎn)移機制是其形成的主要形式。ROS 是正常細胞內(nèi)線粒體進行有氧代謝的副產(chǎn)物，主要包括羥自由基、單線態(tài)氧、超氧自由基等含氧的高活性分子。正常情況下，ROS 可被機體的抗氧化系統(tǒng)清除，ROS 的產(chǎn)生與代謝使ROS 處于相對平衡狀態(tài)。研究表明，ROS 水平的降低可抑制破骨細胞生成并促進骨質(zhì)疏松性骨缺損的再生。Sithole 等研究報道G 蛋白耦聯(lián)受體120 信號可能通過下調(diào)RAW264.7 鼠巨噬細胞的ROS 水平來抑制破骨細胞的形成和吸收，進而延緩骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。He 等在實驗中利用中藥大黃的提取物rhaponticin 干預(yù)RANKL 誘導(dǎo)的破骨細胞，可造成ROS 的產(chǎn)生減少及消耗增加，進而提高抗氧化活性，最終對破骨細胞生成和再吸收產(chǎn)生抑制作用，同時也可為骨質(zhì)疏松癥預(yù)防和治療提供潛在的治療藥物。總之，ROS 的代謝失衡會影響骨代謝的平衡，進而對骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展起著重要的調(diào)節(jié)作用。

3.2 鐵死亡與骨肉瘤

最新研究認為鐵死亡是調(diào)節(jié)癌細胞生長過程中不可忽視的因素。因此，探索鐵死亡相關(guān)調(diào)控機制在骨肉瘤中的作用對該病的認知和治療都具有重要意義。目前二者間直接調(diào)控機制尚不夠明確，但不少中藥提取物及化學(xué)成分卻可靶向調(diào)控骨肉瘤中的鐵死亡。

3.2.1 青蒿素和姜黃素 Isani 等在用純青蒿素和青蒿水醇提取物處理的犬骨肉瘤細胞系D-17 細胞中測量到鐵濃度顯著降低，可能有助于刺激不穩(wěn)定的氧化還原活性鐵池，從而促進ROS 沉積和鐵死亡。Lin 等在研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素的合成類似物EF24以劑量依賴性方式上調(diào)血紅素加氧酶1 表達，而血紅素加氧酶1 可抑制EF24 誘導(dǎo)的GPX4 表達，并通過增加丙二醛、ROS 和細胞內(nèi)鐵離子水平誘導(dǎo)鐵死亡。

3.2.2 異硫氰酸苯乙酯和替拉扎明 Lv 等在人體研究中揭示出異硫氰酸苯乙酯能降低骨肉瘤細胞活力，抑制增殖，并改變與鐵吸收、儲存和輸出過程相關(guān)的鐵代謝，導(dǎo)致不穩(wěn)定鐵增加和GSH 耗竭，誘導(dǎo)ROS 的生成。Lv 等在另一項動物模型研究中證實同基因原位骨肉瘤小鼠用PEITC 以劑量依賴性抑制K7M2 鼠骨肉瘤細胞的活力，最終也能改變鐵代謝并引發(fā)細胞的鐵死亡。所以，不管是在人體中還是動物中，ROS 的產(chǎn)生被證明是PEITC 誘導(dǎo)的骨肉瘤細胞增殖潛能降低、鐵代謝改變、細胞死亡和激活促分裂原活化的蛋白激酶的主要原因。總之，PEITC 可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激同時觸發(fā)骨肉瘤細胞的鐵死亡。

Tirapazamine 是骨肉瘤中調(diào)控鐵死亡的重要藥物，作為一種低氧前體藥物，可有效抑制低氧條件下骨肉瘤的增殖和遷移。Shi 等首次證實tirapazamine在缺氧條件下可抑制SLC7A11 和GPX4 的表達，促進骨肉瘤細胞產(chǎn)生過量的ROS，從而誘發(fā)鐵死亡。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，鐵死亡作為一種鐵依賴形式的新型細胞程序性死亡方式，雖在調(diào)控骨質(zhì)疏松癥及骨肉瘤方面起著重要作用，但內(nèi)在的聯(lián)系仍未闡明；且中藥提取物調(diào)控鐵死亡機制尚不明確，其他中藥成分研究也為之甚少。此外，鐵死亡與細胞凋亡、自噬、焦亡等其他細胞死亡形式之間的關(guān)系也未揭露。這些都將是我們今后進一步探索的方向和目標(biāo)，以期為骨質(zhì)疏松癥與骨肉瘤甚至其他疾病的診治尋求新的有效手段。