甘南牦牛乳中蛋白類活性物質

羅麗 ，崔廣智 ，蘇德亮 ，李亞萍 ，宋禮

1. 甘南牦牛乳研究院（甘南 747000）；2. 甘肅華羚乳品股份有限公司（甘南 747000）；3. 甘肅羚華食品檢測技術服務有限公司（蘭州 730000）

牦牛是生活在高海拔地區的特殊物種，是中國的特色資源，中國現有牦牛超過1 400萬頭，占世界牦?？倲盗康?5%以上[1]。甘南牦牛主要分布在我國合作、瑪曲、碌曲、夏河、卓尼及迭部[2]。與普通牛乳相比，牦牛乳中含有更高的蛋白質、脂肪、乳糖、礦物質等營養物質，且富含免疫球蛋白、轉化生長因子、外泌體等多種免疫相關成分，具有天然、純凈、綠色的特點，是一種天然“濃縮乳”[3-5]。隨著牦牛乳研究的深入和牦牛乳產業的發展，研究牦牛乳中免疫活性物質如免疫球蛋白、A2-β-酪蛋白等營養物質的含量和相互關系對提高牦牛乳質量、促進牦牛乳精深加工、提高牦牛乳附加值具有重要意義。

關于牦牛乳研究的報道較多，但不同地域、不同品種牦牛乳中營養物質含量差異很大，且缺乏對甘南牦牛乳蛋白類活性物質的深入研究，不利于指導企業開發甘南牦牛乳，采用雙抗夾心酶聯免疫技術研究甘南地區牦牛乳中蛋白類活性物質絕對含量及相關性，了解甘南不同地區牦牛乳中微量蛋白含量的特點，為進一步研究甘南牦牛乳各組分的結構和促進甘南牦牛乳的合理利用、功能性食品開發等提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

牦牛奶（分別采自甘肅省甘南州夏河縣、卓尼縣、合作市）；酶聯免疫吸附測定試劑盒：α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、免疫球蛋白（IgA、IgD、IgE、IgG、IgM）、乳鐵蛋白、乳清蛋白、血清白蛋白、A2-β酪蛋白（均購自上海酶聯生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

IF 50酶標儀（瑞士帝肯）；PW 812板洗機（匯松全自動酶標板洗機）；XW-80A渦旋混合器（其林貝爾）；TD-6M離心機（四川蜀科儀器有限公司）；37 ℃恒溫培養箱（上海一恒）；96微孔酶標板；高精度加樣器及槍頭。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

取冷凍牦牛乳樣品，在流水下解凍，將不同地區各樣品于渦旋混合器振蕩5 min充分混勻，分別吸取2 mL各牦牛乳樣品，在4 ℃條件下按5 000 r/min離心15 min，去除脂肪，吸取并保留上清液，即為乳蛋白樣品。

1.3.2 測定方法

不同地區牦牛乳樣品中α-乳白蛋白（α-LA）、β-乳球蛋白（β-Lg）、免疫球蛋白（IgA、IgD、IgE、IgG、IgM）、乳鐵蛋白（LTF）、乳清蛋白（WP）、血清白蛋白（ALB）、A2-β酪蛋白（β-CNA2）分別使用雙抗夾心ELISA試劑盒測定。

從室溫平衡60 min后的鋁箔袋中取出所需板條，設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加50 μL不同濃度的標準品，樣本孔中加入50 μ待測樣本L，空白孔不加。樣本如需稀釋，按照要求用試劑盒配套樣本稀釋液稀釋樣本。每孔加入50 μL生物素標記抗體，用封板膜封住反應孔，在37 ℃水浴鍋溫育30 min，標準孔空白孔不加，用洗板機重復洗板5次。除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入100 μL過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體，用封板膜封住反應孔，在37 ℃水浴鍋溫育30 min，用洗板機重復洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，在37 ℃避光孵育15 min。每孔加入50 μL終止液，15 min內在450 nm波長處測定各孔的吸光度（A），記錄檢測結果。

1.4 數據分析

1.4.1 繪制標準曲線

在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應吸光度作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度。

1.4.2 檢測數據分析

各測定指標的原始數據經過Excel工作表整理后進行統計分析，采用SPSS軟件用鄧肯氏法進行差異顯著性檢驗進行分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以標準樣品濃度為y軸，吸光度為x軸繪制標準曲線，得到α-LA、β-Lg、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、LTF、WP、ALB、β-CNA2的標準曲線回歸方程：y=89.401x-3.448 9，R2=0.998 6；y=123.96x-3.594 3，R2=0.998 4；y=23.468x-1.543 3，R2=0.997 9；y=259.68x-15.04，R2=0.997 3；y=201.24x-8.338 9，R2=0.993 9；y=296.21x-19.515，R2=0.999 9；y=1 133.8x-46.838，R2=0.997 4；y=309.63x-20.72，R2=0.994 7；y= 28.784x-1.530 3，R2=0.992 9；y=67.428x-3.471 2，R2=0.999 3；y=230.67x-11.09 8，R2=0.999 1。通過標準曲線來定量待測樣品中的濃度。由各標準曲線方程可以看出，相關系數R均大于0.99，標準曲線呈現較好的線性關系，表明試驗結果可靠。

2.2 最佳稀釋倍數確定

各樣本牦牛乳中α-LA、β-Lg、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、LTF、WP、ALB、β-CNA2的含量不同，測定時應對奶樣進行一定倍數的稀釋，以確保測定結果在標準樣品濃度范圍內。各蛋白檢測樣本稀釋倍數如表1所示。

表1 最終稀釋倍數

2.3 不同地區牦牛乳α-LA、β-Lg、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、LTF、WP、ALB、β-CNA2的含量分析

將測得的27份牦牛乳樣的吸光度代入相應的標準曲線方程，得到樣本中各蛋白的絕對含量平均值，如表2所示。

表2 牦牛乳中各蛋白絕對含量平均值

有研究表明，致敏性蛋白主要有β-乳球蛋白、α-酪蛋白和β-酪蛋白，與牦牛乳相比，普通牛乳中β-乳球蛋白是牦牛乳中的5倍，所以牦牛奶致敏性更低，可作為嬰幼兒配方奶粉的優質原料[6-7]。由圖1可以看出，甘南地區牦牛乳中含量較高的有免疫球蛋白（IgG、IgM）、A2-β酪蛋白以及乳清蛋白，含量偏低的有血清白蛋白、免疫球蛋白IgA和乳鐵蛋白，因此，試驗結果與上述研究結論一致。為考察不同地區間牦牛乳含量的差異性，進行方差分析。

采用SPSS軟件用鄧肯氏法進行方差分析，各地區牦牛乳間蛋白含量的方差分析結果見表3。

由方差分析表3中顯著性水平值可見，β-Lg、IgA、IgD、IgG、IgM、ALB、β-CNA2在不同地區牦牛乳中含量平均數不具有顯著差異（P＞0.05），α-LA在不同地區牦牛乳中含量平均數具有顯著差異（P≤0.05），IgE、LTF、WP在不同地區牦牛乳中含量平均數具有極顯著差異（P＜0.01）。為比較各地區之間α-LA、IgE、LTF、WP含量的差異程度，進行各地區間平均數的多重比較（Duncan法），檢驗結果見表4。

表3 不同地區牦牛乳中各蛋白含量的方差分析表

表4 不同地區牦牛乳中含量平均值的多重比較表

由表3多重比較結果可知：夏河牦牛乳中α-LA含量最低，為1.211 mg/mL，合作牦牛乳中α-LA最高，為1.476 mg/mL，夏河牦牛乳與卓尼牦牛乳中α-LA含量不具有顯著差異，卓尼牦牛乳與合作牦牛乳中α-LA含量不具有顯著差異，夏河牦牛乳與合作牦牛乳中α-LA含量具有顯著差異；夏河牦牛乳中IgE含量最低，為3.70 mg/mL，合作牦牛乳中IgE最高，為6.71 mg/mL，夏河牦牛乳、卓尼牦牛乳、合作牦牛乳中IgE含量之間均具有顯著差異；卓尼牦牛乳中LTF含量最低，為0.597 mg/mL，合作牦牛乳中LTF最高，為1.009 mg/mL，夏河牦牛乳、卓尼牦牛乳、合作牦牛乳中LTF含量之間均具有顯著差異；夏河牦牛乳中WP含量最低，為4.48 mg/mL，合作牦牛乳中WP最高，為8.53 mg/mL，夏河牦牛乳、卓尼牦牛乳、合作牦牛乳中WP含量之間均具有顯著差異。

3 結論

蛋白類活性物質（乳清蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白、血清白蛋白、A2β-酪蛋白）在甘南地區牦牛乳中的含量差異基本保持一致，均呈現為免疫球蛋白（IgG、IgM）、A2-β酪蛋白以及乳清蛋白含量較高，血清白蛋白、免疫球蛋白IgA和乳鐵蛋白含量較低，其免疫球蛋白和A2-β酪蛋白含量分別為28.57±2.44 mg/mL和5.82±0.39 mg/mL。甘南不同地區牦牛乳中，α-LA、IgE、LTF、WP含量存在顯著差異，但均表現為合作牦牛乳中α-LA、IgE、LTF、WP含量最高。研究表明，甘南牦牛乳是一種營養價值高的乳制品，其免疫球蛋白含量、A2-β酪蛋白具有明顯優勢。隨著牦牛乳中蛋白質組成和含量的進一步研究，牦牛乳可作為獨特、高營養價值的功能型食品的原料，為牦牛乳制品加工提供理論數據。