仲景方辨治驚悸病的特點及高頻藥對桂枝-茯苓核心通路靶點的篩選

王明珠，姚 磊，李建華，桂明泰，蘆 波，周訓杰，符德玉

驚悸多概括在心悸病證中，其本為氣血不足、陰陽虧損，標為氣滯、血瘀、痰濁、水飲等。張仲景在驚悸辨治中創制了許多經典方劑，如桂枝類方、真武湯、五苓散、炙甘草等。通過梳理驚悸病治法與方藥應用，掌握其論治特點及核心藥對，有助于總結歸納仲景方對驚悸病的辨證論治特點，并為后期機制探討提供參考。

1 仲景方辨治驚悸病的特點

驚悸病名源自《黃帝內經》，《金匱要略·驚悸吐衄下血胸滿瘀血病脈證治》提出了驚悸的病名，并系統論述了驚悸病的辨證施治。《說文解字》釋義：“驚，馬駭也”“悸，心跳也”。張仲景論述驚和悸分而別之，條文中言明以脈辨病：“寸口脈動而弱，動即為驚，弱即為悸”。“動”和“弱”的不同，表明了驚和悸的病因病機不同[1]。驚因外感，多屬實證，常見于感受外邪導致心無所依，神無所歸，故脈見動搖不寧；悸因內傷，多屬虛證，常見于氣血不足，心脈失養，故脈象細弱無力[2]。驚，驚恐，抽搐，以精神異常為主要表現，主脈：動脈；多自外來，涉及臟腑主要為心、肝、膽等；悸，以心跳或者其他部位的跳動為主要表現，主脈：弱脈。

“驚”多因臨床表現不同分為驚癇、驚煩、驚狂等分而治之。驚癇者多因風熱被火；驚煩者多因肝郁、邪熱致心神不寧，方劑多選用柴胡加龍骨牡蠣湯；驚狂者多因心陽虛，方劑選用桂枝去芍藥加蜀漆牡蠣龍骨救逆湯。“悸”的辨證多根據部位不同分為心悸、心下悸、心中悸、臍下悸。心悸者，多因心陰不足，選方為炙甘草湯；心下悸、心中悸的辨治，屬心陽虛者用真武湯、桂枝甘草湯。飲停中焦者，茯苓甘草湯主之；水飲凌心者，半夏麻黃丸主之；胃中停水者，小半夏加茯苓湯主之；心血虛者，小建中湯主之；陽虛肢冷者，四逆湯主之；臍下悸者，因心陽虛者苓桂草棗湯主之；水停下焦者，五苓散主之[3]。詳細條目見表1。

表1 張仲景辨治驚悸病的原文條目總結

現代中醫內科學將驚悸包括在心悸中，指病人心中悸動，自覺不安，甚則不能自主的一種病證，多見于現代醫學的心律失常。也可見于貧血、甲狀腺功能亢進等以心律失常為主癥的疾病中。西醫學各種原因引起的心律失常，如心動過速、心動過緩、期前收縮、心房顫動或撲動、房室傳導阻滯、病態竇房結綜合征、預激綜合征及心功能不全、神經官能癥等，凡以心臟跳動不規則為主要臨床表現時，均參考驚悸論治[4]。

2 高頻藥對桂枝-茯苓的基因靶點篩選

通過以上對《傷寒論》以及《金匱要略》中對驚悸病選方用藥的總結，經過統計發現，在治療驚悸病的方劑中，桂枝出現頻率為8次，茯苓出現頻率為6次，兩者配伍多達5次，藥對桂枝-茯苓出現頻率最高。

桂枝其味辛、甘，性溫，歸心、肺、膀胱經，發汗解肌，溫通經脈，助陽化氣，平沖降氣；茯苓其味甘、淡，性平，歸心、肺、脾、腎經，利水滲濕，健脾寧心。桂枝茯苓配伍多用于治療驚悸、氣短、失眠、水腫等癥狀。現代研究發現，桂枝為樟科樟屬植物肉桂的干燥嫩莖，桂枝在治療心血管疾病中主要起增加心血管流量、疏通心肌通透性的作用[5]；茯苓為真菌茯苓的干燥菌核，茯苓與桂枝配伍后對慢性心肌缺血具有更好的保護作用[6]。基于桂枝-茯苓藥對配伍的特殊性，本研究運用現代生物信息學等研究手段，對桂枝-茯苓藥對治療心律失常的作用靶點進行預測及篩選，以期為實驗及臨床用藥提供前期理論基礎。

2.1 桂枝-茯苓化合物-基因靶點互作網絡的構建 桂枝-茯苓化合物-基因靶點互作圖見圖1，內部紅色三角形組成的圓為桂枝-茯苓治療心律失常的主要作用成分，主要包括烯酸(enoic acid)、氫化松苓酸(trametenolic acid)、酒酵母甾醇(cerevisterol)、麥角甾(ergosta)、麥角甾醇過氧化物(ergosterol peroxide)、常春藤皂苷元(hederagenin)、花旗松素(taxifolin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)。外圈綠色為基因靶點。具體操作方法參考文獻[7]。

圖1 桂枝-茯苓化合物與基因靶點的相互作用圖

2.2 桂枝-茯苓核心基因靶點篩選 為了進一步篩選出可能性最大的基因靶點，本研究利用STRING數據庫(http://string-db.org/cgi/input.pl)構建蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡，將獲得的PPI網絡利用Cytoscape軟件中Cytohubba插件進行處理，Cytohubba可以發現復雜網絡的關鍵目標和子網絡并對基因進行篩選，根據nodes在網絡中的屬性，運用12種算法進行統計分析并對核心基因進行排序[8]。結果顯示，基因關聯度排名前20位由高到低為：CASP3、CASP8、CASP9、BCL2、BAS、ADRA1B、ADRB2、ADRA1A、CHRM1、PTGS2、SLC6A4、CHRM2、MAP2、CHRM3、SLC6A2、PGR、PRKCA、OPRM1、NR3C2、NCOA2。詳見圖2。

2.3 桂枝-茯苓干預心律失常的基因功能和信號通路分析 深入探究桂枝-茯苓藥對干預心律失常的基因功能和可能涉及的信號通路，本研究利用DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)將基因靶點進行基因本體功能(gene ontology，GO)分析和京都基因與基因百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，分別篩選出排名前5位的條目進行作圖，見圖3。富集到生物過程GO條目有腺苷酸環化酶抑制G蛋白偶聯乙酰膽堿受體信號通路、磷脂酶C激活G蛋白偶聯乙酰膽堿受體信號通路、突觸傳遞膽堿能、環氧合酶途徑；富集到細胞組成的GO條目有質膜組成、神經元投射、突觸后膜反應、細胞連接；富集到分子功能的GO條目有G蛋白偶聯乙酰膽堿受體活性、前列腺素內過氧化物合酶活性、過氧化物酶活性、半胱氨酸型內肽酶活性。桂枝-茯苓藥對干預心律失常主要信號通路為鈣離子信號通路、細胞凋亡通路、神經活性配體-受體相互作用信號通路。

圖3 桂枝-茯苓藥對干預心律失常GO富集分析以及KEGG通路分析

為了進一步闡釋篩選的核心基因與信號通路的關系，利用R軟件bioconductor程序包，對Bioconductor數據庫(http://www.bioconductor.org/)進行KEGG通路富集分析，結果發現，排名前20位的基因中，富集到排名第1位的信號通路鈣離子信號通路核心基因為CHRM3/CHRM1/CHRM2/ADRA1B/ADRA1A/ADRB2/PRKCA。詳見表2。

表2 KEGG富集分析排名前5位的信號通路

3 討 論

仲景之方，后世多尊之為經方，奠定了中醫學辨證論治的基礎。經方以藥味的不同屬性治療人體不同部位寒熱虛實，從而達到人體自身的陰陽平衡。仲景之方具有明顯的核心傾向，形成以核心藥物為主體，以常用藥對為骨架，構建了以桂枝湯類、麻黃湯類、白虎湯類、承氣湯類、柴胡湯類、理中湯類等為代表的類方方簇。其中，核心藥物為桂枝、芍藥、半夏、人參、茯苓等，核心藥對為桂枝和芍藥、桂枝和茯苓、麻黃和桂枝、人參和半夏、人參和桂枝等。類方方簇在經文中都有各自的適應證，但同類方劑也必然存在基本藥對組成和相似的功用主治[9]。

藥對即臨床常用的、相對固定的兩味藥的配伍組合，是在長期的臨床實踐中由經驗積累而逐步形成的。仲景方中藥對的使用，是仲景常用的一種特定藥物組配和方劑組成。《神農本草經》提出“有單行者、有相須者、有相使者、有相畏者、有相惡者、有相反者、有相殺者，凡此七情， 合和視之”。“七情”概括了藥物配伍的基本形式，藥對也構成了組方用藥的基礎。仲景之方，多含“藥對”，配伍精當，與方劑的功效相關甚切，桂枝-茯苓用藥規律以及其作用機制的研究對臨床有借鑒意義[10]。

本研究發現，仲景方治療驚悸病的方劑中，桂枝-茯苓藥對出現的頻率最高，通過生物信息學分析等手段對桂枝-茯苓藥對的潛在基因靶點和信號通路進行篩選，發現桂枝-茯苓藥對可能通過調控鈣離子通道中的核心基因CHRM3/CHRM1/CHRM2/ADRA1B/ADRA1A/ADRB2/PRKCA干預心律失常。

與本研究結果相似，姜開運等[11]利用現代數據挖掘技術研究發現，《普濟方》中含茯苓復方的治療病證前3名為虛損599首方劑、虛勞305首方劑、驚悸286首方劑。汪瓊等[12]以國醫大師公開發表或出版的醫案醫話為研究對象，挖掘國醫大師應用桂枝常用藥對信息，以及核心藥對與疾病的關聯。結果提示，常用藥物頻次統計在1 133首含有桂枝的處方中，共涉及藥物525味，國醫大師應用桂枝的常用藥對組合有31個，出現頻次最高的藥對是茯苓-桂枝(444次)。這些研究結果表明，不管從仲景方還是后世醫家和近現代名醫在驚悸病的辨證施治中，桂枝-茯苓藥對應用廣泛，發揮了重要作用。

隨著現代醫學對心律失常發病機制的深入研究，發現心臟電信號傳導是心律失常重要發病機制之一[13]。其基礎是心肌細胞跨膜離子通道電流，心肌細胞鈉、鉀、鈣等離子通道順序開放并保持動態平衡是心臟正常工作的基礎。離子通道間功能平衡失調，心肌電信號傳導紊亂，誘發心律失常[14]。越來越多的心律失常被證實與基因缺陷有關，其中多數為心臟離子通道基因異常。鈣離子是維持心臟正常節律及興奮收縮偶聯的關鍵離子，心肌細胞主要存在兩種類型的鈣離子通道：L型鈣通道和T型鈣通道，鈣離子通道相關蛋白的基因突變，可導致嚴重的心律失常[15]。

在一項臨床研究中，研究對象包括213例原發性心肌梗死急性期出現室性心律失常的病人和181例有心肌梗死但沒有室性心律失常的病人。所有病人均無其他心臟病史。采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應對病人進行ADRB2 Gln27Glu多態性基因分型。研究發現ADRB2 Gln27Glu病人更有可能在胸痛后60 min內出現早期室性心律失常，ADRB2基因多態性與原發性心肌梗死早期室性心律失常有關[16]。

體內實驗研究發現，通過依賴鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的Ryanodine受體過度磷酸化可以誘發早期后除極，增強觸發活動，從而導致心房顫動的發生，其主要機制為肌漿網鈣離子釋放與鈉鈣離子交換，導致肌漿網內鈣離子減少和舒張期鈣離子內流。并且動物實驗研究表明有CaMKⅡ磷酸化的RyR2結構的轉基因小鼠對誘導心房顫動的敏感性較強[17]。在體外心肌細胞實驗中，Liu等[18]研究發現，在SD大鼠心肌細胞中，KCNE2基因的高表達可減少L型鈣通路電流(ICa-L)電流，而通過RNA干擾KCNE2表達可升高ICa-L電流，說明KCNE2基因突變可能通過調控ICa-L來干預心房顫動。高齡小鼠(約24月齡)舒張期SR鈣離子泄漏比低齡小鼠(約16周齡)多，KN-93可改善SR鈣離子泄漏[17]。越來越多的證據表明，microRNA在心血管基因表達中發揮調控作用，microRNA可通過影響心臟離子通道基因的表達，引發心律失常。相關的臨床和實驗研究發現，miRNA-1、miRNA-21表達上調可抑制L型鈣通道的表達，進一步引發心律失常等[19-23]。鈣通道阻滯藥主要對心肌細胞中的鈣離子產生抑制性作用，進而降低心肌收縮、心肌耗氧等，起到降低自律性的作用。因此，恢復正常細胞內鈣穩態可成為心律失常的一個潛在的治療靶點[24]。

心律失常的治療是近年來心血管疾病研究的難點和熱點之一，目前抗心律失常藥物的安全性和有效性未能令人滿意。在尋求新的治療策略中，發揮中醫藥的獨特優勢至關重要。目前，中醫藥治療心律失常的臨床研究較多，然而尚缺乏全面深入研究和機制探討，以期在中醫藥治療本病臨床療效的基礎上，發揮中醫藥整體調治、雙向調節的優勢，加強方藥的協同作用分析，更加重視經方的研究，注重拆方和核心藥對的研究。同時運用現代基因測序等技術，著手于更先進、更嚴密的技術支持下，更深入、更全面地掌握中藥抗心律失常的作用機制。在臨床方面進行更大樣本、更具說服力的研究，為臨床提供更有力的依據，使中醫藥治療心律失常的整體水平和科研水平得到進一步提高。