月見草油對蛛網膜下腔出血大鼠EGFR/STAT3通路及運動功能的影響

羅貴聰，任建偉，林奮杰，羅嘉威

蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是主要由動靜脈畸形出血、動脈瘤破裂等導致的常見腦血管疾病，目前在我國的發病率為每年6/10萬～10.5/10萬，致殘率、致死率較高[1]。研究發現，SAH發生后，氧合血紅蛋白等毒性產物及壞死細胞釋放的內容物會激活腦組織炎性反應，引起神經細胞凋亡，導致神經功能缺陷[2]。有數據顯示，60%以上的SAH病人遺留有神經功能障礙后遺癥，嚴重影響病人的日常行動能力[3]。因此，改善SAH后病人的運動功能極為重要。研究發現，神經中樞系統損傷發生時，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在腦組織中的表達水平迅速升高，其可通過磷酸化激活信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號通路，影響腦損傷后的神經功能恢復[4-5]。Peng等[6]研究顯示，GPR30激動劑減弱SAH大鼠神經元凋亡的作用途徑與調控原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(SRC)/EGFR/STAT3信號通路有關。月見草油是從月見草種子中提煉的油脂，用于動物實驗無毒、無副作用，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、免疫調節等各種藥理作用[7-8]。Badri等[9]研究發現，月見草油和電刺激相結合的療法能改善雄性大鼠坐骨神經擠壓傷后的神經功能，但目前月見草油在SAH中的作用尚不明確。基于此，本研究應用月見草油對SAH大鼠進行干預，觀察大鼠運動功能改變及EGFR/STAT3通路激活情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠60只，體質量190～220 g，購自上海茂生衍生物科技有限公司，許可證號：SCXK(滬)2017-0004。

1.1.2 主要試劑 月見草油(貨號：MB8809)購自上海榕柏生物技術有限公司；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號：G1120-10)購自上海信帆生物科技有限公司；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)試劑盒(貨號：KGA702C200)購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；大鼠白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(貨號：KET9001、KET9004、KET9007)購自艾美捷科技有限公司；兔源一抗EGFR抗體、STAT3抗體、磷酸化STAT3(p-STAT3)抗體、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、二抗羊抗兔IgG(貨號：ab52894、ab68153、ab76315、ab186930、ab6721)購自Abcam公司。

1.1.3 主要儀器 酶標儀(型號：Stat Fax-2100)購自美國Awareness公司；光學顯微鏡(型號：AH-2)購自日本Olympus公司；化學發光成像系統(型號：MG8000)購自美國Thmorgan公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及SAH大鼠模型制備 將大鼠按隨機數字表法分為假手術組、SAH組及月見草油低、中、高劑量組，每組12只。SAH組及月見草油低、中、高劑量組大鼠采用頸內動脈穿刺法建立SAH大鼠模型[10]，具體操作為：術前大鼠禁食6 h，按300 mg/kg向大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，以仰臥位固定大鼠，頸部剃毛，皮膚消毒，沿頸部中線剪開皮膚、組織，顯露出右側頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈，在距離頸動脈分叉部位5 mm處用血管夾阻斷頸外動脈，于血管夾近端將頸外動脈剪開，插入4-0單股尼龍線經由頸內動脈進入顱內，感覺有抵抗感后繼續向前推約3 mm，刺穿大腦前動脈與大腦中動脈分叉處，停留15 s后撤回，結扎皮膚并縫合。假手術組大鼠在穿刺線進入顱內有抵抗感時立刻撤回，結扎皮膚并縫合，其余手術步驟與SAH大鼠模型建立步驟相同。手術期間大鼠體溫保持在37 ℃。

1.2.2 給藥處理 術后30 min，月見草油低、中、高劑量組大鼠分別灌胃135 mg/kg、270 mg/kg、540 mg/kg月見草油[11]，假手術組、SAH組大鼠灌胃等量生理鹽水。

1.2.3 大鼠運動神經功能評分 造模成功后24 h，由對分組不知情的實驗者，在安靜環境中對大鼠5 min內自主活動、前肢對稱性、攀籠功能、四肢對稱性、軀體感覺功能和觸須感覺進行評估。滿分18分，評分越低，運動神經功能損傷越嚴重[12]。

1.2.4 HE染色 大鼠運動神經功能評分結束后，每組取6只大鼠，用10%水合氯醛麻醉后將大鼠斷頭處死，冰上取腦。將腦組織置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，冠狀切片，切片厚5 μm。將切片脫蠟至水，HE染色，脫水、透明、封片，每張切片在光學顯微鏡(×400)下隨機選取5個視野觀察腦組織病理學變化。

1.2.5 TUNEL染色 取上述腦組織切片，脫蠟至水，使用TUNEL試劑盒進行檢測，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行，每張切片在光學顯微鏡(×400)下隨機選取5個視野觀察細胞染色情況，統計陽性細胞百分比(即凋亡率)，計算均值。

1.2.6 ELISA檢測腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平 大鼠運動神經功能評分結束后，將每組剩余的6只大鼠用10%水合氯醛麻醉后斷頭處死，冰上取腦，分成兩份。將其中1份腦組織于冰上研磨勻漿，使用ELISA檢測試劑盒及酶標儀檢測IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平。

1.2.7 蛋白質印跡法(Western Blot)檢測腦組織中EGFR、p-STAT3、STAT3蛋白表達水平 將另1份腦組織置于冰上研磨勻漿，加裂解液裂解30 min，離心20 min分離上清液，二喹啉甲酸(BCA)法定量，100 ℃加熱15 min變性，取適量上清液經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用封閉液封閉1.5 h，放在一抗稀釋液(EGFR抗體、STAT3抗體、p-STAT3抗體、GAPDH抗體，1∶1 000)中4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次(每次10 min)，轉移至二抗稀釋液(羊抗兔IgG，1∶2 000)中室溫孵育1 h，電化學發光法(ECL)發光顯色，掃描圖像，Image J分析蛋白條帶灰度，計算目的蛋白與內參蛋白條帶灰度的比值。

2 結 果

2.1 月見草油對大鼠運動神經功能評分的影響 與假手術組相比，SAH組大鼠運動神經功能評分明顯降低(P<0.05)；與SAH組相比，月見草油低、中、高劑量組大鼠運動神經功能評分均明顯升高(P<0.05)；隨著月見草油劑量的升高，大鼠運動神經功能評分依次升高(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠運動神經功能評分比較(±s) 單位：分

2.2 月見草油對大鼠腦組織病理學變化的影響 HE染色結果顯示，假手術組大鼠大腦皮層神經細胞結構正常、核仁清晰、排列整齊，SAH組大鼠大腦皮層神經細胞壞死嚴重，表現為細胞核溶解、碎裂或消失，月見草油低、中、高劑量組大鼠大腦皮層神經細胞的形態結構損傷均有不同程度的減輕。詳見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理學變化(HE染色，×400)

2.3 月見草油對大鼠腦組織細胞凋亡的影響 TUNEL染色結果顯示，與假手術組相比，SAH組大鼠腦組織細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與SAH組相比，月見草油低、中、高劑量組大鼠腦組織細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；隨著月見草油劑量的升高，大鼠腦組織細胞凋亡率依次降低(P<0.05)。詳見圖2、表2。

圖2 各組大鼠腦組織細胞凋亡情況(TUNEL染色，×200)

表2 各組大鼠腦組織細胞凋亡率比較(±s) 單位：%

2.4 月見草油對腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響 與假手術組相比，SAH組大鼠腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯升高(P<0.05)；與SAH組相比，月見草油低、中、高劑量組大鼠腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)；隨著月見草油劑量的升高，大鼠腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平依次降低(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較(±s) 單位：pg/mg

2.5 月見草油對腦組織中EGFR、STAT3、p-STAT3蛋白表達的影響 與假手術組相比，SAH組大鼠腦組織中EGFR、p-STAT3/STAT3蛋白表達均明顯升高(P<0.05)；與SAH組相比，月見草油低、中、高劑量組大鼠腦組織中EGFR、p-STAT3/STAT3蛋白表達均明顯降低(P<0.05)；隨著月見草油劑量的升高，大鼠腦組織中EGFR、p-STAT3/STAT3蛋白表達依次降低(P<0.05)。詳見圖3、表4。

圖3 各組大鼠腦組織中EGFR、STAT3、p-STAT3蛋白表達情況

表4 各組大鼠腦組織中EGFR、STAT3、p-STAT3蛋白表達比較(±s)

3 討 論

SAH是常見的腦血管疾病，損傷機制復雜，會引起早期腦損傷、遲發性腦損傷、腦血管痙攣和全身炎癥反應綜合征[13]。盧子明等[14]研究認為，早期腦損傷對SAH病人預后有重要影響，而炎癥反應是早期腦損傷發生的重要機制。肖剛等[15]研究認為，抑制炎癥反應、氧化應激反應可改善SAH大鼠血腦屏障損傷。本研究采用頸內動脈穿刺法建立SAH大鼠模型，結果顯示，SAH組大鼠腦組織中產生嚴重的炎癥反應，大腦皮層神經細胞出現壞死跡象，腦組織細胞凋亡率明顯升高，大鼠的運動神經功能評分明顯降低，提示SAH發生會引起炎癥反應及腦神經細胞凋亡，造成腦損傷及運動神經功能減退，這與之前的報道結果[13]一致。SAH致死、致殘的主要原因可能是腦血管痙攣和早期腦損傷，但錢達等[16]研究認為，許多藥物成功逆轉腦血管痙攣后，SAH的預后也沒有得到顯著改善，改善早期腦損傷會是未來治療SAH的主要目標之一。Wang等[17]研究發現，改善神經元存活可減輕SAH誘導的早期腦損傷。因此，本研究旨在尋找一種能減輕炎癥反應、降低腦細胞凋亡率的藥物，以改善SAH大鼠的早期腦損傷及運動神經功能。

月見草油是從月見草種子中提取的油脂，含有人體生長必需及人體不能合成的多種不飽和脂肪酸，能發揮抗炎、抗氧化等作用，具有較高的藥用價值，其作為中草藥常用于治療心腦血管疾病[7-8]。本研究結果顯示，使用月見草油干預SAH大鼠后，大鼠腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低，且IL-1β、IL-6、TNF-α水平變化與月見草油劑量有關，提示月見草油可降低SAH大鼠腦部炎癥反應，且隨劑量升高其作用增強。同時，使用月見草油后，SAH大鼠大腦皮層神經細胞的形態結構損傷均有不同程度減輕，腦組織細胞凋亡率亦明顯降低，提示月見草油可以抑制腦組織細胞凋亡并減輕大腦皮層腦組織損傷，可能與腦部炎癥反應減輕有關。以大腦皮層為主的高級中樞是調控運動功能的神經系統。本研究結果也顯示，月見草油降低SAH大鼠大腦皮層腦組織損傷后，大鼠運動神經功能評分明顯升高，提示月見草油能提高SAH大鼠運動功能，可能與抑制炎癥反應、抑制腦組織損傷、抑制腦細胞凋亡有關。

EGFR是一種活性多肽，在上皮、間質及神經組織中廣泛表達，能結合配體將STAT3磷酸化激活，進而調控通路下游多個基因轉錄[18-19]。錢紅等[20-21]研究發現，抑制EGFR/STAT3通路可能是miR-7抑制星形膠質細胞活化的主要作用機制，沉默EGFR可通過阻礙STAT3磷酸化抑制星形膠質細胞活化，促進腦損傷后神經功能恢復。龐金偉等[22]研究亦表明，STAT3通路激活可能參與SAH小鼠早期腦損傷的發生發展過程，并可能與調控SAH發生后的早期神經炎癥反應有關。本研究結果顯示，SAH組大鼠腦組織中EGFR、p-STAT3/STAT3蛋白水平較假手術組明顯升高，提示EGFR/STAT3通路參與SAH的發生。使用月見草油干預治療可降低SAH大鼠腦組織中EGFR、p-STAT3/STAT3蛋白表達，并呈劑量依賴性，提示月見草油可抑制EGFR/STAT3通路激活，并初步推測EGFR/STAT3通路激活受到抑制可能是月見草油發揮降低SAH大鼠炎癥水平、抑制腦組織損傷、抑制腦細胞凋亡、提高SAH大鼠運動功能等作用的機制之一。

綜上所述，月見草油能抑制EGFR/STAT3通路激活，降低炎癥水平，抑制腦細胞凋亡及腦組織損傷，恢復大鼠運動功能，可能為臨床改善SAH病人預后提供重要的理論參考依據。