Keap1/Nrf2/HO-1/GPX4信號通路阻斷癲癇大鼠海馬神經元鐵死亡機制及草果知母湯的干預效應

梁韡斌，張高煉，郭建輝，曾 敬，李 敏，陳 銳，張曉寧，劉姍姍

癲癇作為一種常見的腦部功能障礙疾病，其在我國總體發病率高達0.7%，且1年內癲癇病人發作率為0.45%[1-2]，然而由于癲癇的發病機制復雜多樣，臨床上對于癲癇的治療藥物有限且有效率低，所以加速抗癲癇藥物研發對于改善癲癇病人生活質量具有重要意義。近年來，研究發現癲癇導致的認知功能障礙與Kelch-樣ECH相關蛋白1(Keap1)/核因子E2相關因子2(Nrf2)/血紅素加氧酶-1(HO-1)/谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)通路介導的海馬神經元細胞鐵死亡機制關系密切，且通過調節Keap1/GPX4/Nrf2/HO-1通路蛋白進而抑制海馬神經元細胞死亡成為癲癇治療的新方法[3-4]。草果知母湯作為一種中藥成方制劑，其以中醫理論為指導，具有燥濕清熱之功效，現代醫學研究發現其對癲癇具有顯著的改善作用[5]。本實驗通過研究草果知母湯對癲癇大鼠的改善作用及對Keap1/GPX4/Nrf2/HO-1通路的調節作用，為草果知母湯的藥理作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級6周齡雄性Wistar大鼠60只，體質量180～200 g，購自廣西醫科大學實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK桂2009-0002，實驗動物使用許可證：SYKG桂2009-2005。本實驗遵守了廣西中醫藥大學實驗動物管理與保護的有關準則。

1.1.2 主要試劑 中藥草果知母湯(草果10 g，知母10 g，厚樸10 g，半夏10 g，黃芩10 g，甘草10 g，由廣西中醫藥大學第一附屬醫院研制，批號：20150108，制備方法：將中藥飲片加水回流提取2次，第1次加10倍水提取2 h，第2次加8倍水提取1.5 h，藥液過濾、合并濃縮至含生藥濃度1 g/mL)。戊四氮(PTZ)購于美國Sigma公司(貨號10106150)；丙戊酸鈉(批號201806121，賽諾菲制藥有限公司生產)；GPX4兔多克隆抗體(貨號AF7020)、Keap1兔多克隆抗體(貨號AF7335)、HO-1兔單克隆抗體(貨號AF1333)、Nrf2(貨號AF7623)兔多克隆抗體均購自碧云天生物科技公司；電化學發光(ECL)Plus超敏發光液(貨號PE0010)、蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號G1120)、尼氏(Nissl)染色液(貨號G1434)、總RNA提取試劑盒(貨號R1200)、cDNA逆轉錄試劑盒(貨號T2240)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(貨號A0208)購自北京索萊寶科技有限公司；谷胱甘肽(GSH)(貨號ARB10949)及活性氧(ROS)(貨號ARB14150)檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；鐵含量檢測試劑盒(貨號MBC4350)購自北京麥瑞博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型建立 將60只大鼠隨機分為正常對照組、模型組、草果知母湯低、中、高劑量組和西藥對照組，每組10只。參照文獻[6]方法腹腔注射PTZ 40 mg/kg，隔日1次，連續1個月，造模期間每次注射完畢后觀察1 h，并按照大鼠生理反應及表現進行Racine分級，連續3次出現全面性強直-陣攣發作即判定造模成功，此后PTZ給藥由隔日1次改為每3 d 1次，以維持造模狀態。依據臨床給藥劑量，按照體表面積進行折算，草果知母湯低、中、高劑量組分別給予草果知母湯1.25 g/kg、2.50 g/kg、5.00 g/kg灌胃；西藥對照組給予腹腔注射丙戊酸鈉(200 mg/kg)[7]，每日1次；模型組及正常對照組給予腹腔注射生理鹽水，連續給藥5周。

1.2.2 Racine評分 末次給藥24 h后對大鼠進行Racine評分，0分：無抽搐發作；1分：耳、面部抽搐；2分：肌陣攣，但無直立位；3分：肌陣攣，伴直立位；4分：全面性強直-陣攣發作；5分：全面性強直-陣攣發作，并失去體位控制。

1.2.3 海馬組織GSH、ROS水平及鐵含量檢測 取大鼠海馬組織裂解勻漿，4 ℃，8 000 r/min，離心10 min，取上清，使用GSH、ROS水平及鐵含量檢測試劑盒測定GSH、ROS水平及鐵含量。

1.2.4 HE及Nissl染色病理學觀察 取大鼠海馬組織于中性甲醛中固定后石蠟包埋，4 μm切片，采用HE及Nissl染色試劑盒進行常規HE及Nissl染色，觀察大鼠海馬CA1區病理學改變，并根據Nissl染色結果對海馬CA1區進行神經元細胞計數。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RTq-PCR)檢測海馬組織Keap1、GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平 取大鼠海馬組織，利用RNA提取試劑盒提取總RNA，用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，根據Keap1、GPX4、Nrf2、HO-1及GAPDH引物序列進行RTq-PCR反應，結果以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算海馬組織Keap1、GPX4、Nrf2、HO-1相對表達量。各基因引物序列見表1。

表1 各基因聚合酶鏈式反應(PCR)引物序列

1.2.6 免疫組化法 取海馬組織切片，脫蠟水化后用30%過氧化氫(H2O2)孵育10 min，阻斷內源性過氧化物酶活性，然后用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3 min。將切片在10%的山羊血清中室溫孵育20 min，以阻斷非特異性結合，分別與GPX4、Nrf2兔抗體在室溫下孵育1 h，再次用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，用二抗室溫孵育30 min，切片經DAB染色、蘇木素復染、脫水、干燥后光鏡觀察，用Image-Pro Plus 6.0計算蛋白表達積分光密度(IOD)值。

1.2.7 蛋白質免疫印跡法(Western Blot) 用組織裂解緩沖液提取大鼠海馬組織總蛋白，用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。從每個樣品中取50 μg蛋白，并將其電轉移到硝酸纖維素膜上。用10%脫脂奶粉室溫封閉1 h。然后用Keap1、GPX4、Nrf2、HO-1和GAPDH抗體(1∶500稀釋)在4 ℃孵育過夜，次日在洗滌液中沖洗3次，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育1 h，再次洗滌后滴加化學發光液，在凝膠成像系統中成像并使用Image J軟件定量分析蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 草果知母湯可降低癲癇大鼠Racine評分 與正常對照組比較，模型組大鼠Racine評分升高(P<0.05)；與模型組比較，草果知母湯各劑量組及西藥對照組Racine評分降低(P<0.05)。隨著草果知母湯劑量增加，大鼠Racine評分逐漸降低(P<0.05)。詳見圖1。

模型組與正常對照組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與草果知母湯低劑量組比較，△P<0.05；與草果知母湯中劑量組比較，▲P<0.05。

2.2 草果知母湯可升高癲癇大鼠海馬組織GSH水平，降低ROS水平及鐵含量 與正常對照組比較，模型組大鼠海馬組織GSH水平降低(P<0.05)，鐵含量及ROS水平升高(P<0.05)；與模型組比較，草果知母湯各劑量組及西藥對照組GSH水平升高(P<0.05)，鐵含量及ROS水平降低(P<0.05)。隨著草果知母湯劑量增加，大鼠海馬組織GSH水平逐漸升高，鐵含量及ROS水平逐漸降低。詳見表2。

表2 各組大鼠海馬組織ROS、GSH水平及鐵含量比較(±s)

2.3 草果知母湯保護癲癇大鼠海馬CA1區病理學變化 正常對照組大鼠海馬組織結構正常，未見病理性改變；與正常對照組比較，模型組大鼠海馬組織CA1區炎癥浸潤，神經元缺失，神經元細胞數減少(P<0.05)；與模型組比較，草果知母湯各劑量組及西藥對照組大鼠海馬組織病理學恢復，神經元細胞數增加(P<0.05)。大鼠海馬組織CA1區HE、Nissl 染色檢測結果見圖2、圖3。各組大鼠神經元細胞數比較見圖4。

圖2 大鼠海馬CA1區HE染色結果(×400)

圖3 大鼠海馬CA1區Nissl 染色結果(×400)

2.4 草果知母湯可降低癲癇大鼠海馬組織Keap1、GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平 與正常對照組比較，模型組大鼠海馬組織GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平降低(P<0.05)，Keap1 mRNA水平升高(P<0.05)；與模型組比較，草果知母湯各劑量組及西藥對照組GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平升高(P<0.05)，Keap1 mRNA水平降低(P<0.05)。隨著草果知母湯劑量增加，大鼠海馬組織GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平逐漸升高，Keap1 mRNA水平逐漸降低。詳見表3。

模型組與正常對照組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與草果知母湯低劑量組比較，△P<0.05；與草果知母湯中劑量組比較，▲P<0.05。

表3 各組大鼠海馬組織Keap1、GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平比較(±s)

2.5 草果知母湯抑制癲癇大鼠海馬CA1區GPX4、Nrf2蛋白表達 與正常對照組比較，模型組大鼠海馬CA1區GPX4、Nrf2蛋白表達積分光密度降低(P<0.05)；與模型組比較，草果知母湯各劑量組及西藥對照組海馬CA1區GPX4、Nrf2蛋白表達積分光密度升高(P<0.05)。隨著草果知母湯劑量增加，GPX4、Nrf2蛋白表達積分光密度逐漸升高。詳見圖5～圖8。

圖5 免疫組化法檢測大鼠海馬CA1區GPX4蛋白表達

模型組與正常對照組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05；與草果知母湯低劑量組比較，△ P<0.05；與草果知母湯中劑量組比較，▲ P<0.05。

圖7 免疫組化法檢測大鼠海馬CA1區Nrf2蛋白表達

模型組與正常對照組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05；與草果知母湯低劑量組比較，△ P<0.05；與草果知母湯中劑量組比較，▲ P<0.05。

2.6 草果知母湯可抑制癲癇大鼠海馬組織Keap1、GPX4、Nrf2、HO-1蛋白表達 與正常對照組比較，模型組大鼠海馬組織GPX4、Nrf2、HO-1蛋白表達降低(P<0.05)，Keap1蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，草果知母湯各劑量組及西藥對照組GPX4、Nrf2、HO-1蛋白表達升高(P<0.05)，Keap1蛋白表達降低(P<0.05)。隨著草果知母湯劑量的增加，大鼠海馬組織GPX4、Nrf2、HO-1蛋白表達逐漸升高，Keap1蛋白表達逐漸降低。詳見圖9。

模型組與正常對照組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與草果知母湯低劑量組比較，△P<0.05；與草果知母湯中劑量組比較，▲ P<0.05。

3 討 論

癲癇是由于大腦神經元異常放電進而導致大腦功能障礙的一種慢性疾病，然而，癲癇發作時臨床表現復雜多樣，其發病機制也不盡相同，所以目前臨床對于癲癇的治療方法有限，研發新型抗癲癇藥物是目前臨床的迫切需求。癲癇發作時神經元異常放電會引起海馬神經元損傷，進而可能導致癲癇病人繼發認知功能障礙等疾病。嚴建文[8]研究報道了癲癇大鼠海馬神經元細胞減少，同時海馬組織促凋亡基因表達升高；蔡棟梁等[9]同樣報道了癲癇大鼠海馬組織病理性改變并發生明顯神經元凋亡。因此，在癲癇的治療中，海馬神經元的保護及修復是重要的治療途徑之一。丙戊酸鈉是目前藥理機制明確且臨床應用廣泛的治療癲癇的藥物，所以，本實驗用其作為陽性對照組藥物。

中醫理論認為癲癇歸屬于“癡呆”“癇癥”“癲癥”等范疇，其病因與病人痰濁內生及情緒失調等因素有關。“癇為痰蓄，無痰不作癇”，同時指出癲癇伴認知障礙的病機關鍵在于“腎精虧虛、風痰閉阻”。草果知母湯是在中醫理論指導下由草果、知母等中藥材組成的中藥成方制劑，其最早記載于中醫學著作《溫病條辨》中，具有燥濕清熱的功效。現代醫學研究發現，草果知母湯對癲癇動物模型有顯著改善作用，甘賢兵等[10-11]先后研究發現草果知母湯及其加減方能夠通過提高腦內γ-氨基丁酸(GABA)陽性神經元分布及受體表達進而抑制大鼠癲癇的發作及進展，同時能夠降低大鼠驚厥發作級別。張麗萍等[12]研究發現，草果知母湯能夠抑制癲癇引起的大鼠腦海馬神經元形態結構病理性改變。然而，草果知母湯對于癲癇的治療作用機制及其對鐵死亡的抑制作用目前尚不清楚。

鐵死亡是近年來研究發現的一種新的細胞死亡方式，其機制為細胞在金屬元素鐵的參與下發生脂質過氧化產物和致命性反應ROS積聚導致的細胞死亡，呈現出鐵離子依賴性[13]。許璐等[14]研究發現鐵死亡激活劑能夠誘導小鼠海馬HT22細胞凋亡，并導致細胞內ROS及鐵含量升高，同時抑制海馬組織細胞內鐵含量及ROS水平，從而增強海馬細胞活力，其機制可能與提高海馬HT22細胞內HO-1水平有關。楊田麗等[15]研究發現HT22細胞內鐵含量及脂質過氧化物水平升高則明顯促進HT22細胞凋亡。曾勁松等[16]研究表明神經元鐵超載導致神經元細胞死亡，其機制與細胞內鐵含量升高進而導致GSH水平、GPX-4活性降低及ROS水平升高有關。本實驗結果表明，與模型組比較，草果知母湯能夠明顯抑制癲癇大鼠海馬組織鐵含量及ROS水平，并升高海馬組織GSH水平，且隨著草果知母湯劑量的增加，海馬組織鐵含量及ROS水平明顯降低，海馬組織GSH水平升高更明顯。

研究表明，細胞內Nrf2能夠抑制細胞內氧自由基的活性，修復細胞損傷[17]。在細胞正常狀態下，細胞內Nrf2與Keap1特異性結合，Nrf2的活性受到抑制，但細胞損傷時，Keap1與Nrf2發生解離，Nrf2被激活，進而激活下游HO-1及GPX-4水平，增強組織抗氧化能力，保護組織細胞免受氧化應激損傷。HO-1作為重要的抗氧化酶，在外界刺激及細胞因子引起的細胞氧化應激損傷中發揮重要的保護作用[18]。同時，研究表明，鐵死亡誘導劑可直接或間接作用于GPX4，導致細胞內ROS堆積、觸發細胞氧化死亡機制[19]。GPX4和Nrf2分別通過限制ROS產物和降低細胞內鐵的攝取對鐵死亡發揮負性調控作用[20]，因此，GPX4和Nrf2被認為是海馬組織鐵死亡的直接相關性蛋白。本實驗結果表明，與模型組比較，草果知母湯各劑量組能夠呈劑量依賴性降低大鼠海馬組織Keap1 mRNA及蛋白水平，并升高Nrf2、GPX4及HO-1 mRNA及蛋白水平。

綜上所述，草果知母湯能夠修復癲癇大鼠海馬組織氧化損傷，其機制可能與調節Keap1/Nrf2/HO-1/GPX4通路進而阻斷海馬神經元鐵死亡有關。