肉牛源產ESBLs肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測

陳亮，劉雪松，馮萬宇，張蕾，沈思思，蘭世捷，李丹，苗艷

（黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

0 引言

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）屬于腸桿菌科[1]，可以引起多種疾病，包括肺炎、膀胱炎、心內膜炎及敗血癥等[2]。隨著抗生素的使用，細菌的耐藥性問題逐漸暴露出來并且呈現出愈演愈烈的情況。第3代甚至第4代頭孢菌素等β-內酰胺類抗生素被廣泛應用在治療革蘭氏陰性菌的感染中。但是隨著這些藥物的使用，陰性桿菌的耐藥性問題迅速增強。多種機制可引其革蘭氏陰性桿菌產生β-內酰胺類藥物耐藥性，其中包括了編碼PBPs的基因突變、主動外排泵作用、細胞膜通透性的改變及產生β-內酰胺酶[3]。其中產超廣譜β-內酰胺酶（Extended-spectrum β-Lactamase）是導致陰性腸桿菌產生耐藥性最為常見的機制之一[4]。超廣譜β-內酰胺酶是由基因突變而產生的的一種酶，可水解β-內酰胺環，讓藥物失去活性。根據編碼基因的不同，可將超廣譜β-內酰胺酶分為TEM、CTX-M、SHV以及OXA等分型，其中TEM、CTX-M、SHV是常見的分型。CTX-M耐藥基因存在多種亞型。

2021年10月從黑龍江省齊齊哈爾市周邊肉牛場分離出一株致病性肺炎克雷伯菌，發現其對β-內酰胺類藥物產生了強烈的耐藥性，對其攜帶的耐藥基因進行探究，為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

致病性肺炎克雷伯君分離于黑龍江省齊齊哈爾周邊肉牛場。

1.1.2 試劑與儀器

腦心浸出液培養基、MH瓊脂培養基，均購自青島海博生物技術有限公司。Taq Master Mix以及DNA Marker，購自大連Takara公司。Bio-Rad梯度PCR儀，購自伯樂生命醫學產品有限公司。藥敏紙片購自杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.1.3 試驗動物

清潔級昆明雌鼠6只，6周齡，體重大致在30～36 g，購自齊齊哈爾醫學院實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 細菌純化

將臨床分離到的肺炎克雷伯菌劃線接種到BHI瓊脂培養基上，連續劃線3代，將細菌進行純化。

1.2.2 細菌致病性試驗

將純化后的細菌用BHI營養肉湯培養到1.5×108CFU/mL后，試驗組3只小鼠腹腔注射0.2 mL。對照組3只注射無菌生理鹽水。

1.2.3 藥敏試驗

根據CLSI的指導進行藥敏試驗。將細菌菌液培養到0.5麥氏單位，將菌液均勻涂抹于MH瓊脂平板上，將藥敏紙片均勻放置在平板上，2個藥敏紙片間距不低于24 mm，一個平板上最多放置5個藥敏紙片。

1.2.4 耐藥基因檢測

用DNA提取試劑盒提取DNA模板，進行耐藥基因PCR檢驗。總體積為25 μL，其中模板2 μL，上下游引物各1 μL，Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。

2 結果

2.1 致病性試驗

將分離得到的細菌經過純培養后，對小鼠進行腹腔注射。試驗小鼠在4 h內全部死亡，經過剖檢發現死亡小鼠的脾臟、肝臟有出血點。將死亡小鼠進行心血涂片，鏡檢發現與克雷伯菌形態一致，該株細菌有致病性。

2.2 藥敏試驗

藥敏試驗看出該株致病性肺炎克雷伯菌對β-內酰胺類藥物皆產生了耐藥性，對氟喹諾酮類處于敏感狀態。

2.3 耐藥基因

耐藥基因結果如圖1所示，通過PCR發現該株菌株含有CTX-M-2基因，為攜帶CTX-M-2耐藥基因的產超廣譜β-內酰胺酶細菌。

圖1 耐藥基因PCR鑒定結果

3 討論

克雷伯菌屬為革蘭氏陰性桿菌，其主要包含肺炎克雷伯菌、臭鼻克雷伯菌、鼻硬結克雷伯菌等。其中肺炎克雷伯菌的致病性較強，在多種動物中都曾分離出肺炎克雷伯菌。從陜西某規模化豬場中分理處一株具有致病性的肺炎克雷伯菌，并對其進行了藥敏試驗以及耐藥基因的檢測。從內蒙古通遼某羊場病死羊中分離出了一株致病性肺炎克雷伯菌，并對其攜帶的毒力基因進行了探究。從遼寧某小白鵝廠中分離出一株肺炎克雷伯菌，并對其致病性進行了探究。肺炎克雷伯菌分布廣，并且致病動物種類多，對動物健康安全及公共衛生安全都造成了不小的威脅。隨著抗生素的逐漸使用，細菌耐藥性問題逐漸嚴重。其中肺炎克雷伯菌對β-內酰胺類藥物的耐藥性問題被許多研究人員關注。付霞麗對一株致病性豬源肺炎克雷伯菌的耐藥基因攜帶情況進行了檢測，發現其攜帶SHV耐藥基因，為產超廣譜β-內酰胺酶的肺炎克雷伯菌。蘇小艷對2株大熊貓源肺炎克雷伯菌的耐藥基因進行了檢測，發現其中一株細菌攜帶SHV+TEM+CTX-M-1耐藥基因，另一株攜帶SHV+CTX-M-1耐藥基因。從廣東肇慶某豬場中分離出一株豬源肺炎克雷伯菌，經過耐藥基因檢測，發現其攜帶SHV耐藥基因。面對著肺炎克雷伯菌如此嚴重的耐藥性問題，研究人員提出了許多對應的解決方法。其中中藥作為我國的瑰寶，其在聯合抗生素治療肺炎克雷伯菌以及逆轉耐藥性上起到了重要作用。金銀花的有效成分綠原酸聯合左氧氟沙星可有效對產超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌的生物膜起到抑制作用，從而達到優良的抗菌效果。黃連素可有效抑制肺炎克雷伯菌的生長，并且可消除其耐藥質粒，從而逆轉其耐藥性。清金化痰湯與頭孢哌酮或舒巴坦聯合應用對產超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌在體外環境下具有明顯的協同抑制作用。通過以上的報道可以看出，中藥單獨使用或者聯合抗生素使用，對產超廣譜β-內酰胺酶的肺炎克雷伯菌具有良好的抗菌效果，并且能在一定程度上消除細菌的耐藥質粒，扭轉其耐藥性。

4 結束語

從黑龍江省齊齊哈爾市周邊肉牛場分離出一株對β-內酰胺類藥物耐藥的肺炎克雷伯菌，通過耐藥基因檢測，了解其攜帶的耐藥基因及耐藥機制。通過藥敏及耐藥基因檢測試驗，可有效為該肉牛場因該株耐藥菌株產生的疾病防治提供依據。