谷子NCED3基因克隆及生物信息學和表達模式分析

王艷珂，黎飛飛，陳二影，楊延兵，管延安，高文偉，秦嶺

(1.新疆農業大學農學院，新疆 烏魯木齊 830000；2.山東省農業科學院作物研究所，山東 濟南 250100)

脫落酸(abscisic acid，ABA)是植物五大天然生長調節劑之一，能參與植物響應多種逆境脅迫如干旱、冷害、鹽害等的生理反應和分子生物學效應[1]，且能誘導植物產生對不良環境的抗性(抗旱性、抗寒性、抗病性、耐鹽性等)，是植物的“抗逆誘導因子”[2，3]。植物體內ABA的形成有直接和間接兩種途徑，現在越來越多的證據表明高等植物主要以間接途徑合成ABA[4]。9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)通過剪切9-順式新黃質和9-順式紫黃質促使ABA前體黃質醛形成，是ABA生物合成途徑中的關鍵限速酶[5]。NCED基因不僅是啟動ABA積累的直接因素，也是控制ABA合成、影響合成ABA信號強度的重要因素。

在玉米中鑒定到的VP14基因是第一個被發現的NCED基因[6]，隨后在其它植物如煙草[7，8]、大豆[9]、柱花草[10]、馬鈴薯[11]、草莓[12]等中也克隆到了NCED基因。在擬南芥中最先完成了NCED基因家族的鑒定工作，目前已從中鑒定出9個NCED基因[13]，其中有5個與ABA合成相關(AtNCED2，AtNCED3，AtNCED5，AtNCED6，At-NCED9)。從水稻中鑒定到5個NCED基因家族成員(OsNCED1，OsNCED2，OsNCED3，OsNCED4，OsNCED5)，其中，OsNCED1與水稻的耐旱能力相關，OsNCED2的表達水平與延遲種子萌發有關，OsNCED3可調節水稻在干旱環境中的ABA水平和抗逆性，OsNCED4影響水稻的結實率與產量[14]。在其它植物中也發現NCED受逆境脅迫誘導表達，如ABA和低溫脅迫均能誘導茶樹的CsNCED1基因顯著上調表達[15]；高鹽、低溫、干旱、外源ABA、NAA處理均可不同程度地誘導GmNCED1在大豆葉片及根中表達[16]；干旱、高鹽、低溫和高溫4種非生物脅迫可不同程度地誘導GmNCED5的表達[17]；PmNCED1的表達量隨著糜子受PEG脅迫時間的延長而升高[18]。但NCED基因的表達模式因物種和脅迫處理的不同而具有明顯差異。

長期以來，模式植物擬南芥和水稻在引領重要科學發現和先進研究技術方面扮演著十分重要的角色。然而，擬南芥和水稻都是C3植物，在作為C4禾谷類作物的模式植物時有很大的局限性。谷子具有抗旱、耐瘠薄和高光效等突出優勢[19]，恰恰彌補了擬南芥和水稻作為模式植物的不足，是極具發展潛力的C4禾谷類模式植物[20]。但目前關于谷子NCED基因及其差異表達分析的研究報道甚少。本研究從谷子品種濟谷22中克隆獲得SiNCED3，并對其進行生物信息學分析，同時通過實時熒光定量PCR分析其在谷子不同組織及不同脅迫處理下的表達差異，以期為深入探究SiNCED3的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料處理及樣品采集

供試谷子品種為山東省農業科學院作物研究所育成的濟谷22。

2021年4月于光照培養箱內進行谷子幼苗培養，設置溫度25℃、光照/黑暗16 h/8 h、光強8 000 lx，待幼苗長至四葉期時，一部分取地上部分樣品，液氮速凍后放-80℃超低溫冰箱保存，用于SiNCED3的克隆；一部分進行逆境脅迫處理。

共設置3種逆境脅迫處理:干旱處理，于培養液中加入20%(w/v)PEG-6000模擬干旱；鹽脅迫處理，于營養液中加入120 mmol/L NaCl；4℃低溫處理。以正常培養為對照。分別在處理0、3、6、12、24、48 h取地上部分樣品，做好標記，液氮速凍后放-80℃超低溫冰箱保存，用于基因表達分析。以上試驗均進行3次生物學重復。

2021年6月在大田種植的濟谷22開花期前，取根、莖、葉、葉鞘、穗，液氮速凍后放-80℃超低溫冰箱保存，用于SiNCED3在不同組織中的表達分析。

1.2 總RNA的提取及反轉錄

將-80℃保存的不同試驗材料置于研缽中用液氮研磨成粉后，按照植物基因組總RNA提取試劑盒(SparkJade)的說明書進行提取，之后采用1%瓊脂糖凝膠檢測，使用cDNA反轉錄試劑盒(TaKaRa)將RNA反轉錄為cDNA，用于基因克隆及實時熒光定量PCR。

1.3 SiNCED3基因全長克隆

根據Phytozome(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)公布的谷子NCED基因序列(Seita.9G156500)設計引物(F:5′-ATGGCGATGCTTGTTCGGGGTCTCGCTCCGCCGCCCACCTCTGTTTCTT CCATACACC-3′；R:5′-CTACGAGTCCTCACGTGGAGGTAGGTGGGGAAC-3′)，由上海生工生物工程股份有限公司合成，然后以反轉錄的濟谷22 cDNA為模板進行PCR擴增。擴增體系總體積50 μL，包括2×PCR Buffer for KOD FX 25.0 μL，2 mmol/L dNTP 10.0 μL，Primer F、R各1.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 10.0 μL，KOD FX 1.0 μL。將各組分清彈混勻，短暫瞬時離心收集于離心管底，將離心管置于PCR儀中進行擴增。反應程序為:94℃2 min；98℃10 s，56℃30 s，68℃2 min，35個循環；68℃5 min，4℃保存。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，以Marker 2000做比對，切下目的片段，按照膠回收試劑盒(SparkJade)回收目的片段。將目的片段克隆至pEasy-Blunt載體(TransGen Biotech)，轉化大腸桿菌，涂含有Amp的抗性LB培養基過夜培養，挑選單克隆搖菌，菌液送鉑尚生物技術有限公司測序，測序結果用DNAMAN進行比對。

1.4 生物信息學分析

使用在線軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測基因啟動子，并用Phytozome獲取基因序列上游2 000 bp的啟動子序列，進行順式元件分析。

使用在線軟件ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的基本理化性質，包括氨基酸數、分子量、等電點、不穩定系數和平均親水系數等。

利用SignalP 4.1 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-4.1)，輸入氨基酸序列，預測是否含有信號肽結構。

利用WoLF PSORT Prediction(https://psort.hgc.jp/)輸入氨基酸序列，進行亞細胞定位預測，選擇預測膜定位分析數量最高的作為亞細胞定位結果。

使用CDD數據庫在線網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，輸入氨基酸序列，進行保守結構域預測。

從NCBI數據庫中搜索并下載擬南芥、水稻、玉米、煙草、狗尾草的NCED蛋白氨基酸序列，利用MEGA 11軟件中內置的鄰接法(Neighbor-Joining)構建它們與SiNCED3蛋白氨基酸序列的系統進化樹，其中Boot-strap重復次數默認1 000。

使用PBIL的SOMPA在線網站(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page＝npsa_sopma.html)，輸入氨基酸序列，Number of conformational states設置 選 擇4(Helix，Sheet，Turn，Coil)，Similarity threshold設置選擇8，進行蛋白二級結構分析。三級結構利用Expasy的SWISSMODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)進行預測，根據氨基酸排列規則，選擇整體質量估計分數高的構建蛋白質三級結構模型。

1.5 實時熒光定量PCR

根據艾科瑞(AG)生物工程有限公司的熒光定量染液SYBR Green試劑盒進行實時熒光定量PCR，反應體系如下:2×SYBR Green ProTaqHS Premix 5.0 μL，引物各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL，cDNA 1.0 μL，總體積10.0 μL。實時熒光定量PCR程序設置如下:預變性95℃2 min；PCR反應95℃5 s，60℃30 s，72℃30 s，40個循環；溶解曲線95℃5 s，60℃1 min，95℃持續；保溫50℃30 s。所 有 數 據 經 擴 增 谷 子Actin基 因(LOC101779009)進行均一化處理，每個基因進行3次重復，依據2-△△Ct方法[21]對SiNCED3的相對表達量進行分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結果與分析

2.1 SiNCED3基因的克隆

經PCR擴增，獲得一條約2 000 bp的條帶(圖1)。切膠回收連接至pEasy-Blunt載體，轉化大腸桿菌過夜培養后，挑取陽性單克隆進行測序，DNAMAN比對和NCBI-Blast結果顯示，其CDNA全長1 836 bp，與水稻OsNCED3(XM_015776052.1)相似性高達89.63%。并將序列上傳NCBI(OM674734)。

圖1 SiNCED3基因PCR擴增圖譜

2.2 啟動子元件分析

如表2、圖2所示，除含有較多基本元件Abox、TATA-box、CAAT-box外，SiNCED3基因還含有較多光響應元件，占比達到21%，另外還含有2種激素響應元件(ABRE、TGA-element)和2種脅迫響應元件(GC-motif、MBS)。這些順式作用元件可能導致SiNCED3參與谷子對非生物脅迫的應答。

表2 啟動子元件分析結果

圖2 SiNCED3啟動子元件分布

2.3 SiNCED3蛋白基本理化性質及結構分析

2.3.1 基本理化性質SiNCED3編碼一個含有611個氨基酸的蛋白，蛋白相對分子質量為66.36kD，等電點(pI)為6.15，脂肪族系數為79.08，不穩定指數為39.90，親水指數平均為-0.212，推測SiNCED3蛋白是一個穩定的疏水蛋白；信號肽預測結果顯示其無信號肽序列，屬于非分泌蛋白。亞細胞定位于葉綠體。

保守結構域預測結果(圖3)顯示，SiNCED3蛋白氨基酸序列的第12～611位特定匹配于NCED家族保守結構域PLN02258，內含一個NCED家族典型結構域RPE65。

圖3 SiNCED3蛋白結構域

2.3.2 二、三級結構預測 預測結果(圖4)表明，SiNCED3蛋白二級結構主要由無規則卷曲和延伸鏈構成，其平均占比分別為58.10%和21.77%；α螺旋和β轉角較少，其平均占比分別為15.06%和5.07%。三級結構預測結果(圖5)顯示，預測模板為3npe.1.A(9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶蛋白)，SiNCED3蛋白與3npe.1.A匹配度高達93.33%，兩個蛋白的三級結構圖極其相似，GMQE值為0.9，表明模型整體質量較好，預測結果可用。

圖4 SiNCED3蛋白二級結構

圖5 SiNCED3蛋白三級結構

2.4 SiNCED3蛋白進化分析

用NCBI中公布的擬南芥、水稻、玉米、煙草、狗尾草的NCED氨基酸序列與SiNCED3的氨基酸序列構建蛋白進化樹，結果(圖6)顯示，可分為兩個分支，SiNCED3與同屬于單子葉C4作物的玉米NCED4親緣關系最近。

圖6 SiNCED3蛋白系統進化樹

2.5 SiNCED3基因表達模式分析

2.5.1 在谷子不同組織中的表達 結果(圖7)表明，SiNCED3在根、莖、葉、葉鞘、穗中均有表達。在根中的表達量最高，相對表達量顯著高于在其它組織中；在莖中的表達量次之，顯著高于在穗和葉中的表達量；在葉中的表達量最低。

圖7 SiNCED3在不同組織中的表達量

2.5.2 在不同逆境脅迫下的表達 結果(圖8)表明，3種脅迫處理均可不同程度誘導SiNCED3的表達。20% PEG-6000處理6 hSiNCED3表達量最高(8.87)，約為對照的8倍。鹽脅迫處理下，SiNCED3在處理0～12 h表達量較高，處理6 h達到最高(3.57)，24～48 h表達量極低。4℃低溫脅迫處理下，SiNCED3基因表達量呈現先升高后下降再升高的趨勢，最高值出現在處理3 h，相對表達量為8.00，處理48 h出現第2個峰值，相對表達量為7.44。

圖8 SiNCED3在不同逆境脅迫下的表達量

3 討論與結論

ABA在植物的生長發育和脅迫耐受性過程中發揮著重要作用。本研究從濟谷22中克隆獲得ABA合成的關鍵限速酶基因SiNCED3，該基因編碼611個氨基酸，其蛋白無信號肽序列，屬于非分泌蛋白，亞細胞定位于葉綠體中，與玉米的ZmNCED4親緣關系最近，二級結構主要由無規則卷曲和延伸鏈構成；該基因啟動子序列中除含有基本元件(A-box、TATA-box、CAAT-box)外，還含有光響應元件(sp1、G-box、GT1-motif、LAMPelement)、激素響應元件(ABRE、TGA-element)和逆境脅迫響應元件(GC-motif、MBS)，可能導致SiNCED3參與谷子對非生物脅迫的應答。

早期人們認為，植物葉片是ABA合成的主要部位[22]。后來證實，離體的根系，特別是根尖(根毛區至根冠)，在緩慢脫水時能合成大量ABA；非離體根在脅迫下也能夠合成ABA。其它器官如花、果實和種子也能合成ABA。本試驗結果也表明，SiNCED3在谷子根、莖、葉、葉鞘、穗中均有表達，且在根中的表達量最高，在葉中的表達量最低。

ABA在植物營養生長過程中的一個重要功能是調節植株對干旱、鹽分、寒冷等逆境脅迫的反應。王贊等[23]研究表明低溫脅迫能夠誘導茶樹中CsNCED2基因顯著上調表達；Huang等[24]研究表明高鹽和干旱脅迫都顯著誘導了水稻地上部和根部的OsNCED5表達。本研究結果也證實干旱、高鹽以及低溫脅迫誘導了谷子體內SiNCED3基因的表達，其中，干旱脅迫3～6 h的表達量較高，鹽脅迫3～12 h的表達量較高，而4℃低溫處理3 h和24～48 h的相對表達量較高。初步表明SiNCED3能夠參與谷子對逆境脅迫的響應，可為進一步研究該基因的功能奠定基礎。