外源褪黑素對鉻脅迫下百日草種子萌發及幼苗生理特性的影響

朱紅霞，李賽楠，蘇文青，李小輝，張家洋

(1.新鄉學院生命科學與基礎醫學學院，河南 新鄉 453003；2.新鄉市金苑邦達富農業科技有限公司，河南 新鄉 453003)

鉻(Cr)是對人體毒害最大的五種重金屬元素之一，主要以兩種價態——Cr3+和Cr6+存在，其中，Cr6+對生態環境的影響尤為嚴重，可誘使生物體產生突變、癌變和畸變[1]，并可抑制植物種子萌發、降低生物量、破壞光合作用、打破活性氧代謝平衡、干擾養分吸收及轉運等，嚴重時會導致植物死亡[2，3]。

褪黑素(melatonin，MT)即N-乙酰基-5-甲氧基色胺，屬于吲哚類色胺，廣泛存在于動植物體內。MT不僅對植物生長過程具有良好的調控能力，而且對各種不良環境因素造成的傷害也有一定的抵御作用，能夠使植物對低溫、干旱、高鹽、重金屬脅迫等逆境的抵抗力得以增強[4]。目前已知MT可通過激發抗氧化酶系統清除氧自由基，間接促進次生代謝產物的合成，修飾細胞壁，從而減輕細胞損傷，緩解植物重金屬脅迫[5]。如鎳(Ni)脅迫下添加MT可明顯促進水稻(Oryza sativa)幼苗根系生長，降低O2·-產生速率，提高可溶性蛋白含量[6]。砷(As)脅迫下，外源MT能夠提高水稻種子萌發能力、幼芽抗氧化酶活性和根系活力，減輕膜脂過氧化損害[7]。鎘(Cd)脅迫下，MT處理能提高大頭菜(Brassica junceavar.megarrhiza)幼苗的光合色素含量，降低各器官Cd積累[8]；提高蘿卜(Raphanus sativusL.)葉片抗氧化酶活性，降低活性氧積累，緩解氧化脅迫[9]；通過提高抗氧化防御能力，增強油菜(Brassica napusL.)對Cr的抗逆性[10]。

百日草(Zinnia elegans)為菊科一年生草本花卉[11]。花色艷麗、株型美觀、花期長、觀賞價值高，是園林綠化的常用花卉。目前，對百日草的研究主要集中在栽培應用等方面，施加外源物質調控耐重金屬Cr脅迫的研究較少，MT對抗性的調控在園林植物中應用的報道也不多見。因此，本試驗研究了施加不同濃度外源MT對Cr脅迫下百日草種子萌發和幼苗生理的影響，旨在為緩解重金屬脅迫對植物的毒害研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021年9—11月在河南新鄉學院植物生態實驗室和植物組織培養實驗室內進行。供試百日草品種為‘夢境’，購自青島黃瀧種子有限公司。供試外源MT(分析純，純度99%)，南京都萊生物技術有限公司。供試Cr脅迫試劑為重鉻酸鉀(K2Cr2O7，分析純)，上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗設計

1.2.1 種子萌發試驗 2021年9月初對百日草種子Cr敏感度進行了前期試驗，結果表明用100μmol/L K2Cr2O7處理后，其根長僅約為對照的1/4，受到了較大程度傷害但不致死，因而確定本試驗最適Cr脅迫濃度為100 μmol/L。

2021年9月25日，選取整齊度一致、籽粒完整且品質好的百日草種子，先用自來水洗去表面雜質，然后用10%次氯酸鈉消毒10 min，無菌水沖洗后溫水(28℃)浸泡12 h。在每個鋪有2層濾紙的培養皿(φ＝90 mm)中擺放浸泡好的百日草種子50粒，分別加入10 mL含有不同濃度Cr和MT的處理液。試驗設7個處理，具體見表1，每個處理重復4次。將所有培養皿置于溫度25℃、相對濕度75%、14 h光照/10 h黑暗、光照強度為500 μmol/(m2·s)的環境中培養，并以稱重法增補水分以維持處理液濃度基本恒定。以胚根突破種皮1 mm視為有效萌發，每天定時記錄種子萌發情況，連續培養7 d。

表1 各處理MT和Cr濃度 (μmol/L)

依據《國際種子檢驗規程》[12]，分別于第4天和第7天統計發芽勢和發芽率:

式中:Gt指t日內發芽數，Dt指相應發芽天數，S指萌發第7天幼苗的長度。

1.2.2 幼苗培養試驗 2021年10月15日開始進行幼苗生長試驗。種子消毒方法同1.2.1。消毒后將百日草種子均勻播種于裝有滅過菌的珍珠巖育苗缽(直徑18 cm，高16 cm)內，前期每天用適量蒸餾水澆灌，出苗7 d后間苗，每盆留長勢一致、分布整齊的幼苗20株，換1/2劑量的Hoagland營養液進行培養，待幼苗長至10 cm左右進行試驗處理。將K2Cr2O7用1/2Hoagland營養液配制成Cr濃度為100 μmol/L的溶液對幼苗進行澆灌，將MT配制成濃度分別為0、50、100、200、400、600 μmol/L的溶液進行葉面噴施。試驗設7個處理，同表1，每個處理30缽。CK1從處理之日起每3 d在百日草葉面噴灑蒸餾水1次至葉面全濕，有液珠滴落為止，并在處理當日向營養缽中澆灌1/2Hoagland營養液20 mL，處理第7天再次澆灌1/2Hoagland營養液20 mL；CK2從處理之日起每3 d在百日草葉面噴灑蒸餾水1次至葉面全濕，有液珠滴落為止，在處理當日和第7天向營養缽中分別澆灌100 μmol/L Cr脅迫溶液20 mL；T1—T5從處理之日起每3 d在百日草葉面噴灑相應濃度的MT溶液1次至葉面全濕，有液珠滴落為止，并在處理當日澆灌100 μmol/L Cr脅迫溶液20 mL，處理第7天再次澆灌100 μmol/L Cr脅迫溶液20 mL。第14天收樣，選取生長同部位的葉片測定各生理指標。

可溶性糖和可溶性蛋白含量的測定參照陳建勛[13]的方法；葉綠素含量采用80%丙酮浸提法測定[14]；丙二醛(MDA)含量的測定參照寇江濤等[15]的方法；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性的測定參照高俊鳳[16]的方法。

1.3 數據處理

運用Microsoft Excel 2010進行數據整理與繪圖，SPSS 22.0進行數據分析，用ANOVA和LSD法進行單因素方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 外源MT對Cr脅迫下百日草種子萌發的影響

從表2可以看出，與CK1相比，Cr脅迫(CK2)顯著抑制了百日草種子萌發(P＜0.05)，發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數分別降低25.94%、30.12%、32.21%和47.28%。Cr脅迫下噴施不同濃度MT后，隨MT濃度的增加各萌發指標呈先升高后降低的規律。T1、T2、T3和T4處理對Cr脅迫下百日草種子萌發有顯著促進作用(P＜0.05)，其中T2處理效果最佳，發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數較CK2分別升高27.42%、37.35%、46.39%和82.63%。隨著MT濃度的進一步升高，T3和T4處理的促進作用明顯下降，T5處理各指標與CK2不存在顯著差異(P＞0.05)。

表2 外源MT對Cr脅迫下百日草種子萌發的影響

2.2 外源MT對Cr脅迫下百日草幼苗可溶性糖、可溶性蛋白含量的影響

如圖1所示，與CK1相比，Cr脅迫(CK2)下百日草幼苗中可溶性糖、可溶性蛋白含量均顯著升高(P＜0.05)，分別升高了14.27%和20.34%。與CK2相比，各噴施外源MT處理的可溶性糖、可溶性蛋白含量均明顯升高，除T5處理下可溶性糖含量差異不顯著外，其他處理差異均達顯著水平(P＜0.05)，且均在T2處理下達到最大值，較CK2分別升高49.53%和54.14%，此后隨MT濃度的繼續升高呈降低趨勢。表明適宜濃度的MT在一定程度上可以提高Cr脅迫下百日草幼苗的滲透調節能力，增強對Cr脅迫的抗性。

圖1 外源MT對Cr脅迫下百日草幼苗可溶性糖(A)和可溶性蛋白(B)含量的影響

2.3 外源MT對Cr脅迫下百日草幼苗葉綠素含量的影響

由表3可見，與CK1相比，Cr脅迫(CK2)處理下百日草幼苗的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量顯著下降(P＜0.05)，分別降低39.49%、54.35%和43.67%。施加MT后，隨MT濃度的增加，葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量呈先升后降趨勢，均在T2處理時達到最大值，較CK2分別升高62.91%、136.50%和79.71%；但繼續升高MT濃度對Cr脅迫的緩解作用逐漸減弱，百日草幼苗葉綠素含量下降，但仍均顯著高于CK2。表明噴施外源MT可緩解Cr脅迫對百日草幼苗光合色素積累的損害。

表3 外源MT對Cr脅迫下百日草幼苗葉綠素含量的影響 (mg/g)

2.4 外源MT對Cr脅迫下百日草幼苗MDA含量的影響

由圖2可知，Cr脅迫(CK2)處理下百日草幼苗MDA含量達到最大值，與CK1相比顯著增加1.13倍(P＜0.05)。施加不同濃度MT后，MDA含量隨MT濃度的增加呈先下降后上升的趨勢，但均顯著低于CK2，在MT濃度為100 μmol/L(T2)時達到最小值，和CK2相比降低49.49%，與CK1無顯著差異(P＞0.05)。當MT濃度高于100 μmol/L時，MDA含量逐漸升高，對Cr脅迫造成氧化損傷的緩解作用逐漸減弱。

圖2 外源MT對Cr脅迫下百日草幼苗MDA含量的影響

2.5 外源MT對Cr脅迫下百日草幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖3可以看出，與CK1相比，單一Cr脅迫處理(CK2)明顯降低了百日草幼苗的抗氧化酶活性，SOD和CAT活性分別降低16.71%和12.25%，差異顯著；POD活性降低16.71%，但差異不顯著。施加不同濃度MT后，與CK2相比，百日草幼苗SOD、POD和CAT活性顯著升高(P＜0.05)，且三種酶活性均在T2處理下達到最大值，分別升高43.89%、119.95%和65.49%；此后隨MT濃度繼續升高，抗氧化酶活性逐漸降低，高濃度MT(T5)作用下，SOD活性與CK1無顯著差異，而POD和CAT顯著高于CK1。

圖3 外源MT對Cr脅迫下百日草幼苗SOD(A)、POD(B)和CAT(C)活性的影響

3 討論與結論

Cr是一種重金屬污染物，高濃度Cr脅迫可以抑制植物細胞分裂，影響根系對有機物質的吸收，導致植物葉片發黃，光合作用降低，生物量減少[17]。種子萌發時對Cr十分敏感，高濃度Cr脅迫會使植物種子內糖和蛋白質等生理代謝發生紊亂，活性氧增多，膜脂過氧化加重，種子萌發受到抑制[18]。MT作為一種重要的植物生長調節物質，能夠增強植物對干旱、高溫和重金屬等非生物脅迫的抗性[19]，促進種子內球蛋白和微管微絲的合成，增強乙醛酸循環中相關酶的活性，進而促進細胞分裂，并為種子萌發提供能量[20]。本研究中，100 μmol/L Cr脅迫下，百日草種子萌發受到顯著抑制，而施加50～400 μmol/L外源MT對百日草種子的萌發有明顯的促進作用，且在100 μmol/L時緩解效果最優；但當MT濃度升高到600 μmol/L時促進作用不明顯。這與黃益宗等[7]對水稻種子在As脅迫下施加MT的研究結果基本一致。

植物在重金屬脅迫下自身能發生適應性反應，組織細胞內會合成和積累大量可溶性糖及可溶性蛋白等滲透調節物質，以維持細胞內的滲透勢[21]。唐懿等[22]研究表明，MT處理可顯著提高Cd脅迫下豌豆幼苗可溶性蛋白含量。本研究中，單一Cr脅迫下，百日草幼苗的可溶性糖和可溶性蛋白含量有所升高，可能是由于百日草為應對脅迫啟動了自我保護機制，促進了可溶性糖的積累和蛋白質的合成；施加不同濃度MT后，可溶性糖和可溶性蛋白含量進一步顯著升高，說明MT增強了這種保護機制，并以100 μmol/L MT處理效果最佳。表明適宜濃度的MT處理可以通過提高可溶性糖和可溶性蛋白含量，維持細胞內的滲透平衡，緩解Cr脅迫對百日草的傷害。

重金屬脅迫會抑制葉綠素酸酯還原酶的活性，破壞葉綠體膜結構，導致光合作用效率降低，植物生長受到影響[23]。本研究發現，Cr脅迫下百日草幼苗的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量均顯著降低，而施加不同濃度MT后均顯著升高。MT對Cr脅迫的緩解作用可能與其能防止葉綠素的降解有關[24]，也可能與其減弱了重金屬對葉綠素酸酯還原酶的抑制作用、為葉綠體膜結構提供了保護、增強了有機物的吸收能力、活化了光合反應相關酶類有關[22]。表明適宜濃度MT處理能夠提高百日草幼苗葉綠素的含量，從而減輕Cr脅迫的毒害，促進植株正常生長。

植物處于重金屬脅迫時，細胞內活性氧產生與清除之間的平衡被打破，大量自由基積累會引起膜脂過氧化，MDA是膜脂過氧化的產物之一，其含量高低表征膜脂過氧化程度[25]。植物體自身的SOD、POD和CAT等抗氧化保護酶類，能清除脅迫產生的活性氧，從而減輕植物受到的傷害[26]。本研究表明，Cr脅迫下，百日草幼苗的MDA顯著積累，而外源MT處理顯著抑制了MDA的積累，緩解了膜脂過氧化程度，維持了細胞膜的穩定性，提高了對重金屬Cr脅迫的抵抗能力；50～400 μmol/L MT處理顯著提高了Cr脅迫下百日草幼苗的SOD、POD和CAT活性，并以100 μmol/L MT處理效果最佳。這與蔣航等[27]對水稻的研究結果大致相似。

綜上所述，100 μmol/L Cr處理對百日草種子萌發和幼苗生長造成了嚴重的抑制作用。適宜濃度的外源MT能夠通過增強百日草幼苗的抗氧化酶活性提高對活性氧和自由基的清除能力，降低膜脂過氧化對細胞膜系統的傷害，有效抑制葉綠素降解酶活性，提高葉綠素含量，從而緩解重金屬鉻脅迫帶來的傷害，促進百日草種子萌發及幼苗的生長，且以100 μmol/L MT處理緩解效果最佳。