丹參根腐病病原菌的分離、鑒定及防控藥劑篩選

李程錦，尚懷國，蘇霞，郭文秀，王瀚悅，門興元，李麗莉，宋瑩瑩，高龍飛，馬國蘋，于毅

(1.山東省農業科學院植物保護研究所/山東省植物病毒學重點實驗室，山東 濟南 250100；2.全國農業技術推廣服務中心，北京 100125；3.山東省農業技術推廣中心，山東 濟南 250100)

丹參(Salvia miltiorrhizaBunge)又名赤參、山參、紅參、紫丹參等，入藥歷史悠久，是唇形科鼠尾草屬植物[1]，種植范圍分布于遼寧、北京、山東、河南等地[2，3]，是我國傳統醫學中使用最早和最普遍的中藥材之一[4-6]。現代臨床醫學中它主要應用于治療心血管疾病、缺血性腦卒中和惡性腫瘤等疾病，還具有養血、安神等功效[7-9]。

根腐病是丹參生產中的一種主要病害，近年來，隨著連作和種植結構的改變而普遍發生，危害嚴重。根腐病主要危害丹參根部，嚴重影響其產量和品質。發病初期，最先危害丹參的側根和須根，發病部位呈水漬狀，后由紅褐色逐漸加深，并迅速擴展到主根，根切后可以看到維管束發生褐色病變，后期根皮呈纖維狀，極易拔出，植株地上部枯萎[10-12]。研究發現，根腐病的主要致病菌為鐮刀菌[13]。鐮刀菌的寄主范圍廣，能從根部侵染多種植物，發生根腐病，是重要的植物病原菌[14]。

山東省蒙陰縣連城鎮對山莊村丹參根腐病發生較重，發病率較高，致使丹參產量下降，品質降低。因此，為更加有效地防控丹參根腐病，降低丹參根腐病的發病率，提高收入，本試驗對該地區丹參根腐病進行病原菌的分離鑒定、致病性測定和藥劑篩選，以期為防治丹參病害提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

于2019年10月在山東省蒙陰縣連城鎮對山莊村發病嚴重區域采集具有典型根腐病癥狀丹參病株。

1.2 病原菌的分離與純化

將病株洗凈晾干，在超凈工作臺上用手術刀從病健交界處切取約1 cm2的組織塊，75%乙醇消毒30 s后，再用1%次氯酸鈉溶液消毒10 s、無菌水漂洗3次[15]，最后用滅菌濾紙吸干多余水分，接種于PDA培養基中央，25℃恒溫培養箱中倒置培養5 d，待菌絲長出后采用挑取菌絲尖端法進行多次純化。

1.3 病原菌的形態學鑒定

將分離得到的菌株接種在PDA培養基上，25℃恒溫培養箱中倒置培養1～2周，肉眼觀察菌絲的生長狀況、菌落顏色和質地；顯微鏡下觀察菌絲形態、孢子類型、孢子形狀、有無隔膜等，并拍照。根據觀察到的病原菌形態特征，參考《植物病原真菌學》[16]對病原菌進行形態學鑒定。

1.4 病原菌的分子生物學鑒定

將分離菌株接種到PDA培養基上，25℃恒溫培養箱中倒置培養5～7 d。刮取200 mg新鮮菌體，用研磨器研磨后按DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取，4℃冰箱保存。

采用真菌rDNA-ITS序列通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR擴增[17]。PCR擴增體系(25 μL):2×EsTaqPlus Master-Mix(Dye)12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴增程序:95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個循環；72℃延伸5 min。4℃保存。

PCR擴增產物由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將測定的rDNA-ITS序列在GenBank數據庫中進行Blastn比對分析。使用MEGA 7.0軟件中的鄰接法構建系統發育樹，確定菌株的種類。

1.5 病原菌的致病性測定

菌株在PDA培養基上培養5～7 d，用無菌水配制成濃度為1×106個/mL的孢子懸浮液[18]。室溫條件下采用灌根接種法[19]將孢子懸浮液均勻接種在丹參健株根部周圍，接種量為10 mL/株[20]，對照組用無菌水澆灌植株。每個處理重復3次，分別在接種第10、20、30 d觀察植株發病情況。待接種丹參植株出現根腐病的典型癥狀后，切取植株發病部位的病健交界處，再次分離病原菌，比較前后兩次得到的病原菌是否相同，即按柯赫氏法則完成對病原菌的回接及再分離試驗。

1.6 室內藥劑篩選

供試藥劑:98%吡唑醚菌酯原藥、96%嘧菌酯原藥、95%丙環唑原藥、96.3%苯醚甲環唑原藥、2 000億/克孢子枯草原粉，均購自山東康喬生物科技有限公司。

采用菌絲生長速率法[21]進行丹參根腐病菌對5種供試藥劑的敏感性測定。將供試藥劑配制成不同濃度梯度的含藥培養基，以等體積無菌水為對照，每個處理重復3次。將分離菌株接種到含有不同殺菌劑濃度的PDA平板上，25℃恒溫培養箱培養。7 d后測量不同藥劑濃度菌落直徑，并計算抑制率[22]。

抑制率(%)＝(對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑×100 。

利用DPS 7.05軟件進行相關統計分析，以藥劑濃度對數作為橫坐標，以抑制率轉換為幾率值作為縱坐標，求相關系數(r)、毒力回歸方程，從而計算各種供試藥劑對病原菌的抑制中濃度(EC50)[23]。

1.7 盆栽藥效試驗

供試藥劑:40%丙環唑(山東兆豐年生物科技有限公司)、10%苯醚甲環唑(先正達南通作物保護有限公司)。

灌根接種法:將分離菌株在PDA培養基上培養5～7 d，用無菌水配制成孢子懸浮液，濃度約為1×106個/mL。室溫條件下將分生孢子懸浮液均勻接種在丹參健株根圍，接種量為10 mL/株，定期觀察并記錄植株的發病情況。配制6個不同濃度梯度的藥劑，待丹參植株表現明顯癥狀后，對患病丹參植株進行灌藥處理，以無菌水為對照。分別于灌藥10、20 d后觀察丹參植株的發病情況，并統計丹參植株的病情指數。

丹參根腐病分級標準[24]:0級，無病；1級，根莖有少量病斑；3級，根莖病斑較多，維管束褐色，尚未木質化；5級，病根有部分開始腐爛，腐爛部分占根莖體積30%以下；7級，腐爛部分占根莖體積30%以上，地上部植株萎蔫變黃；9級，根莖腐爛，植株枯死。

病情指數＝∑(各級病級株數×各級級值)/(調查總株數×最高級值)×100 ；

防治效果(%)＝(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數×100 。

2 結果與分析

2.1 病原菌形態學特征

經分離純化共得到3種不同形態的菌株，分別命名為形態組Ⅰ、形態組Ⅱ和形態組Ⅲ。形態組Ⅰ菌株氣生菌絲為黑色，形態組Ⅲ菌株氣生菌絲絨毛狀，產淺粉色色素，平均日生長量分別為5.8 mm和5.9 mm，孢子呈橢圓形；形態組Ⅱ菌株氣生菌絲為絨毛狀，不產色素，平均日生長量為7mm，孢子呈鐮刀形(圖1)。

圖1 病原菌菌落形態

根據觀察到的病原菌形態特征，再參考相關文獻，初步確定病原菌為鐮刀菌屬真菌。

2.2 病原菌分子生物學鑒定

丹參根腐病病原菌形態組Ⅰ菌株rDNA-ITS擴增序列約538 bp，形態組Ⅱ菌株約527 bp，形態組Ⅲ菌株約548 bp(圖2)。由系統發育樹(圖3)可知，形態組Ⅰ和形態組Ⅲ菌株與尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporumstrain WZ-67)親緣關系最近；形態組Ⅱ菌株與木賊鐮刀菌(Fusarium equisetistrain UMAS MS25)親緣關系最近，結合形態學鑒定結果，確定丹參根腐病病原菌為尖孢鐮刀菌和木賊鐮刀菌。

圖2 3種形態菌株PCR擴增產物電泳圖

圖3 基于rDNA-ITS序列采用鄰近法構建代表菌株及其相似菌株的系統發育樹

2.3 致病性分析

接種分離菌10 d后丹參葉片開始出現變色萎蔫癥狀，20 d后丹參地上部分根莖逐漸開始變色進而枯黃，30 d后發病嚴重植株出現明顯干枯癥狀。此時取發病嚴重丹參植株帶回實驗室后將根部洗凈，發現地下部分出現明顯腐爛癥狀。第30 d發病率分別達81%、75%、84%(表1)，發病植株癥狀與田間癥狀相同，且對照組無發病癥狀。將患病根部進行病原菌分離，得到的病原菌特征與原接種病原菌相同，并且分離純化后的病原菌80%為形態組Ⅱ菌株，證明木賊鐮刀菌是丹參根腐病的主要致病菌。

表1 病原菌的致病性測定

2.4 室內藥劑篩選

通過計算抑制率可以判斷供試藥劑相對毒力大小，抑制率高的藥劑相對毒力就大[25]。結果(表2)表明，5種藥劑對木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌都有一定的抑制效果，且抑制率與藥劑濃度成正比，但不同藥劑之間抑制效果存在差異。95%丙環唑對木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌抑制效果較好，濃度為1 100、2 200、4 400 mg/L時對木賊鐮刀菌的抑制率分別為81.28%、90.08%、94.85%；275、550、1 100、2 200、4 400 mg/L的95%丙環唑對尖孢鐮刀菌的抑制率分別為84.63%、90.07%、96.86%、100%、100%。96.3%苯醚甲環唑對木賊鐮刀菌的抑制效果較好，濃度為480、960、1 920、3 840 mg/L時對木賊鐮刀菌的抑制率分別為84.04%、85.08%、87.36%、88.07%。2 000億/克孢子枯草原粉對尖孢鐮刀菌的抑制效果較好，濃度為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L時對尖孢鐮刀菌的抑制率分別為83.39%、86.81%、89.25%、89.89%、91.20%。96%嘧菌酯和98%吡唑醚菌酯對木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌抑制效果較差。

表2 5種藥劑對丹參根腐病病原菌菌絲生長的影響

2.5 5種藥劑對丹參根腐病病原菌的室內毒力

98%吡唑醚菌酯、96%嘧菌酯、95%丙環唑、96.3%苯醚甲環唑、2 000億/克孢子枯草原粉對木賊鐮刀菌的EC50分別為474.1955、837.5054、97.0750、17.6659、0.3195 mg/L，對尖孢鐮刀菌的EC50分 別 為92.8179、1 820.2780、46.4313、16.0471、0.0520 mg/L(表3)。因此，5種藥劑對木賊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌的毒力均為2 000億/克孢子枯草原粉＞96.3%苯醚甲環唑＞95%丙環唑＞98%吡唑醚菌酯＞96%嘧菌酯。

表3 丹參根腐病病原菌對5種藥劑的敏感性

2.6 盆栽藥效試驗

盆栽藥效試驗結果(表4)表明，分別用100、200、300、400、500、600 mg/L的10%苯醚甲環唑處理患病丹參植株，10 d后藥劑的防治效果分別為14.65%、31.82%、32.83%、49.75%、63.38%、78.54%，20 d后藥劑的防治效果分別為38.11%、49.48%、67.31%、68.88%、78.91%、88.99%。分別用500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L的40%丙環唑處理患病丹參植株，10 d后藥劑的防治效果分別為22.73%、27.27%、27.27%、36.36%、77.27%、79.55%，20 d后藥劑的防治效果分別為44.93%、47.03%、58.04%、74.83%、89.69%、91.96%。由此可知，10%苯醚甲環唑和40%丙環唑對丹參根腐病的防治效果均較好，并且防治效果隨藥劑濃度的升高而增加。

表4 丹參根腐病盆栽藥效試驗結果

3 討論與結論

鐮刀菌屬是目前為止發現的真菌病原體中危害較為嚴重的屬種之一[26]，可在許多經濟作物中引發多種病害，例如根腐病、莖腐病、維管束枯萎病和果實腐爛病[27]。國內關于丹參根腐病的研究發現，不同地區丹參根腐病的病原菌存在一定差異。山東省萊蕪地區引起丹參根腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌，聊城市和四川省的病原菌則為腐皮鐮刀菌[22]。本研究發現山東省蒙陰縣連城鎮對山莊村丹參根腐病病原菌為木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌。

唐菲菲[28]研究發現，10%苯醚甲環唑能夠有效抑制由尖孢鐮刀菌引起的桔梗根腐。劉昌云等[29]在防治黃連根腐病時發現25%丙環唑可有效抑制菌絲活性以及病原菌生長。張成玲等[30]研究表明，枯草芽孢桿菌在田間防治由尖孢鐮刀菌引起的甘薯根腐病效果最好。本研究中，0.4 mg/L的2 000億/克孢子枯草原粉對尖孢鐮刀菌的抑制率為91.20%；3 840 mg/L的96.3%苯醚甲環唑對木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的抑制率分別為88.07%、79.07%；4 400 mg/L的95%丙環唑對木賊鐮刀菌的抑制率為94.85%，2 200 mg/L的95%丙環唑對尖孢鐮刀菌的抑制率為100%。這些試驗結果為實際生產中防治丹參根腐病提供了理論依據。在用藥劑防治丹參根腐病的同時，可配合其他防治措施如農業防治、生物防治等來提高丹參根腐病的防控效果。

本研究鑒定出的山東省蒙陰縣連城鎮對山莊村丹參根腐病的病原菌為木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌，兩種病菌均能單獨引起丹參根腐病，但兩種病菌的生物學特性有待進一步測定。室內藥劑篩選和盆栽藥效試驗發現2 000億/克孢子枯草原粉、96.3%苯醚甲環唑和95%丙環唑對丹參根腐病病原菌的抑制率、10%苯醚甲環唑和40%丙環唑對丹參根腐病的防治效果較好，但是其田間防治效果、藥劑殘留量等問題還有待進一步研究。