響應面優化黑果腺肋花楸花色苷咀嚼片配方

馬子龍，李海龍，米帥，杜彬，李軍，朱鳳妹*

1. 河北科技師范學院食品科技學院（昌黎 066600）；

2. 河北科技師范學院河北省天然產物活性成分與功能重點實驗室（秦皇島 066000）

黑果腺肋花楸是一種薔薇科植物，喜潮濕，來源于北美[1-2]。其提取物具有較強的抗氧化、抗炎和降血脂等功效[3-4]。

黑果腺肋花楸果實酸澀，難以直接食用，這使其發展受到限制，但在歐美等國家，其中富含的花色苷物質被廣泛應用于醫藥和功能性食品行業[5]。花色苷具有良好的抗氧化活性，可以清除人體內多余的氧化自由基，研究發現花色苷可以顯著抑制內皮細胞中活性氧（ROS）的升高，同時抑制抗氧化活性酶的降低[6-7]。

當前攝入花青素的方式仍為食補，關于其制劑的研究非常少。在此背景下以黑果腺肋花楸果粉為主要原料，通過在制備工藝中添加花色苷純品提高花色苷含量，采用響應面優化法探究咀嚼片制備的最佳工藝，并對其咀嚼性、硬度等進行測定，為咀嚼片的制備提供較為直觀可靠的參考依據。此外，對其抗氧化性進行了研究，此制備工藝可增加花楸產品的創新性和多樣性，為花楸產業的發展開闊思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

黑果腺肋花楸凍果（種植于遼寧省海城市，2019年9月上旬采收）；β-環糊精、淀粉、甘露醇、檸檬酸（食品級，浙江一諾生物科技有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2, 2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，純度98%，上海源葉生物科技有限公司）；維生素C咀嚼片（含20% VC，浙江康恩貝科技有限公司）；HP-20大孔吸附樹脂（上海昕滬實驗設備有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

質構儀（Brookfielb CT3，上海茂默科學技術有限公司）；EYELA真空冷凍干燥機（FDU-1200，北京五洲東方科技發展有限公司）；數控超聲波清洗器（KQ5200DB，昆山市超聲儀器有限公司）；可見分光光度計（V-5100，武漢高精密科學儀器有限公司）；多沖壓片機（MYP-9，廣州市揚鷹醫療器械有限公司）；超微粉碎機（RS-FS1401，合肥榮事達小家電有限公司）；旋轉蒸發儀（N1100，上海愛朗儀器有限公司）；pH示差計（FE28-Standard，梅特勒托利多科技有限公司）。

1.3 試驗條件

1.3.1 黑果腺肋花楸果粉的制備

將黑果腺肋花楸凍果洗凈，去除壞果與果梗，于-20 ℃冷凍過夜，于真空冷凍干燥機凍干，超微粉碎機制粉，過0.150 mm（100目）孔徑篩，備用。

1.3.2 黑果腺肋花楸花色苷的制備

參考文獻[8-10]的方法制備花色苷。取適量花楸，提取溶劑為40%乙醇（含0.5%檸檬酸），按照料液比1∶10（g/mL）、提取溫度43 ℃，超聲功率200 W輔助提取23 min。抽濾后，于45 ℃旋轉蒸發濃縮。利用HP-20大孔吸附樹脂進行純化，凍干后，得純化后花色苷樣品，備用。

1.3.3 黑果腺肋花楸花色苷咀嚼片制備工藝

參考劉魁等[11]的制備方法。黑果腺肋花楸凍干后，超微粉碎，過0.150 mm（100目）孔徑篩。按比例稱取果粉與各種原料，混合均勻后制片，制片過程中根據情況補加潤濕劑。

1.3.4 花色苷含量的測定

采用pH示差法測定黑果腺肋花楸花色苷含量[12]，用分光光度計測定A510nm和A700nm，花色苷含量（g/100 g）計算見式（1）。

式中：ΔA=（A510nm-A700nm）pH 1.0-（A510nm-A700nm）pH 4.5；V為樣品體積，mL；F為稀釋倍數；Eav為平均消光系數，98.20；m為樣品質量，g。

1.3.5 性能判定

參考李剛鳳等[13]壓片工藝評分標準，以外觀、口感質地、相對片劑標準偏差、風味為評價指標進行評分，評分標準見表1。

表1 評分標準

1.3.6 單因素試驗

配方固定花色苷含量20%、微粉硅膠0.5%、乙醇體積分數75%，以果粉、甘露醇、β-環糊精和檸檬酸的添加量為考察因素，通過調整各因素比例，以淀粉填充至100%，探究不同因素對咀嚼片感官評分的影響。固定果粉30%、甘露醇10%、β-環糊精10%、檸檬酸2%，分別考察果粉（2 0%，2 5%，3 0%，35%和40%）、β-環糊精（5%，10%，15%，20%和25%）、甘露醇（5%，10%，15%，20%和25%）和檸檬酸（1%，2%，3%，4%和5%）對感官評分的影響。

1.3.7 響應面優化

采用SPSS軟件對單因素試驗結果進行分析，選出3個對壓片評分影響顯著的因素——花楸果粉添加量（X1）、β-環糊精添加量（X2）和甘露醇添加量（X3）。每個變量分別以-1，0和1進行編碼，因素和水平見表2。采用Design-Expert對試驗數據進行回歸分析。

表2 響應面試驗因素水平設計 單位：%

1.3.8 質構性質測定

采用質構儀對咀嚼片的性能進行測定，測試條件：樣品高度7 mm，檢測速度60 mm/min，起始力0.1 N，形變量25%，間隔時間1 s。同時以市面上的VC咀嚼片為對照。

1.3.9 抗氧化活性研究

分別取1片VC片和1片花色苷壓片，碾碎，待測。將粉末用無水乙醇配制成10，20，30，40和50 μg/mL，實際VC與花色苷質量濃度約為2，4，6，8和10 μg/mL，同時配制相同質量濃度的花色苷溶液。采用朱璐等[14]的方法測定DPPH自由基清除率；采用黃彪等[15]的方法測定ABTS自由基清除率；重復3次取平均值，按式（2）計算清除率。

式中：A0為空白液代替樣液的吸光度；A1為樣液與自由基溶液的吸光度；A2為空白液代替自由基溶液的吸光度。

1.4 數據處理

采用IBM SPSS 21對單因素試驗結果進行顯著性分析，采用Design Expert 8.0進行響應面設計，試驗數據使用Origin軟件繪制統計圖。

2 結果與分析

2.1 花色苷提取與純化

前期研究中根據HPLC-MS分析得到，黑果腺肋花楸花色苷主要含有3種單體，分別為矢車菊素半乳糖苷、矢車菊素-3-阿拉伯糖苷和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，每種單體在花色苷樣品中所占比例分別為47.31%，20.04%和10.80%，共占花色苷樣品的78.15%，表明黑果腺肋花楸花色苷經純化后的純度很高。

2.2 單因素試驗

2.2.1 果粉

黑果腺肋花楸中含有單寧等物質，果實酸澀，因此果粉添加量對片劑的感官品質具有十分重要的影響，過多的果粉會使片劑酸澀難食，而果粉過少會減弱黑果腺肋花楸特有的果香。由圖1可以看出，果粉添加量在35%左右出現峰值，在保證口感的同時，還能夠體現花楸果實特有果香，統計學分析顯示該因素對感官評分具有顯著影響（P＜0.05）。

圖1 果粉對感官評分的影響

2.2.2β-環糊精

花色苷穩定性差，而β-環糊精是一種很好的藥物包合材料，可以提高藥物的穩定性，還可以改善藥物的溶解度、溶出速率和生物利用度[16]。由圖2看出，隨著β-環糊精添加量的增加，感官評分逐漸升高，并在10%時出現峰值，隨著添加量繼續增加，片劑過硬，且過量白色的β-環糊精與深紫色的果粉混合后，顏色發灰，色澤暗淡。可見β-環糊精添加量對片劑也有重要影響，且統計學分析顯示該因素對評分影響顯著（P＜0.05）。

圖2 β-環糊精對感官評分的影響

2.2.3 甘露醇

甘露醇溶解時吸熱，有甜味，對口腔有舒服感，十分適用口中清涼劑等咀嚼片的制造[17]。由圖3可知，甘露醇添加量的增加，可以提高片劑的評分，10%時達到峰值，隨著添加量繼續增加，甘露醇的甜味掩蓋果粉的香味，不具特色。可見甘露醇添加量也是一個重要的影響因素。統計學分析顯示該因素具有顯著影響（P＜0.05）。

圖3 甘露醇對感官評分的影響

2.2.4 檸檬酸

檸檬酸具有溫和爽快的酸味，非常適合掩蓋黑果腺肋花楸果粉的澀味[18]。由圖4可以看出，檸檬酸的添加確實提高了壓片的風味評分，受到一致好評，但因個人對酸度的耐受性差異，使得該因素對感官評分并無顯著影響（P＞0.05），添加量3%左右的酸度較為適宜，因此后續試驗采用3%檸檬酸添加量。

圖4 檸檬酸對感官評分的影響

2.3 響應面優化試驗

2.3.1 響應面結果與分析

根據單因素試驗結果，以果粉添加量（A）、β-環糊精添加量（B）、甘露醇添加量（C）為自變量，感官評分（Y）為因變量做響應面試驗。試驗設計及結果見表3。對表3試驗數據進行多元回歸擬合，果粉添加量（A）、β-環糊精添加量（B）和甘露醇添加量（C）與感官評分（Y）的二次多項回歸模型編碼方程為Y=96.76-6.26A+10.09B+3.08C-3.97AB+3.50AC-3.60BC-14.09A2-17.64B2-5.32C2。

表3 響應面試驗結果表

從表4可以看出，各因素一次項和交互項均達到顯著水平（P＜0.05）。這表明，試驗因子對響應值并不是簡單的線性關系，二次項與交互項都對響應值有很大影響。

表4 獨立變量響應面模型方差分析

判定系數R2=0.984 6，R2越接近1，表明該模型擬合程度越好，也越能預測其響應值。同時，失擬項為0.173 6＞0.05，失擬項不顯著，說明方程擬合充分，回歸方程極顯著（P＜0.01）。因此，可用上述回歸方程描述各因子與響應值的關系，對不同條件下片劑的感官評分進行預測。

根據回歸方程作出不同因子的響應面分析圖，結果見圖5～圖7。三維圖坡度較大，說明響應值對這些交互因素的改變越敏感。圖5～圖7的等高線圖呈橢圓形表明其交互作用顯著，這與表4分析結果一致。

圖5 果粉添加量與環糊精添加量對感官評分影響的響應面圖及等高線圖

圖6 環糊精添加量與甘露醇添加量對感官評分影響的響應面圖及等高線圖

圖7 果粉添加量與甘露醇添加量對感官評分影響的響應面圖及等高線圖

2.3.2 驗證試驗

通過Design-Expert 8.0軟件得到黑果腺肋花楸花色苷咀嚼片的最佳制備條件：果粉添加量33.74%、β-環糊精添加量11.49%、甘露醇添加量15.52%。在此工藝下黑果腺肋花楸花色苷咀嚼片的感官評分理論值為99.24分。根據實際操作的可行性，調整為果粉添加量34%、β-環糊精添加量11%、甘露醇添加量16%。按照此條件制備咀嚼片，3次平行試驗取平均值，感官評分為97.33分，與理論值接近，這就說明響應面優化的結果具有可信度。

2.4 花色苷含量測定

采用pH示差法測定每片中花色苷含量，結果為44.04±7.57 mg。花色苷推薦攝入量為50 mg/d。成人花色苷抗氧化保健功能有效成分的日服用劑量為140～ 160 mg[19]。因此每日服用1片，可保證每日花青素攝入量，滿足人體的基本需求。每日服用3～4片，可以起到抗氧化功效，可以對疾病起到預防和改善的功效。

2.5 質構性質測定

硬度是最直接反映口感的一項指標，在質地剖面分析中，直接影響咀嚼性。由表5可以看出，花色苷咀嚼片硬度1與VC咀嚼片無顯著差異，硬度較為適中，但第二次下壓花色苷咀嚼片硬度明顯下降，二者差異顯著，進一步結合二者的彈性相比較，從表5可以看出花色苷咀嚼片的彈性顯著高于VC咀嚼片，花色苷咀嚼片偏韌性強，VC咀嚼片偏脆硬，且二者的咀嚼性無顯著差異，黏性較小，不易粘牙，通過咀嚼性、硬度等指標數據化，對于片劑的性質判定更加直觀。

表5 性能測試表（x±S，n=10）

2.6 抗氧化性測定

2.6.1 DPPH自由基清除率

DPPH是一種比較穩定的脂性自由基，呈紫色，加入抗氧化劑以后，紫色褪去，其褪色程度與其接受的電子數呈定量關系[20]。由圖8可以看出，質量濃度小于6 μg/mL時，VC咀嚼片的清除率高于花色苷咀嚼片和花色苷，大于6 μg/mL時，花色苷清除率較高，在10 μg/mL時，花色苷咀嚼片的抗氧化性顯著高于VC咀嚼片，表明花色苷咀嚼片具有較好的抗氧化性。

圖8 不同質量濃度下三種抗氧化劑對DPPH自由基清除率的影響

2.6.2 ABTS自由基清除率

ABTS法是一種被廣泛用于檢測物質體外抗氧化能力的方法[21]。由圖9可以看出，VC清除ABTS自由基的能力較差，花色苷與花色苷咀嚼片的清除ABTS自由基的能力顯著高于VC咀嚼片（P＜0.05），花色苷咀嚼片與花色苷的清除ABTS自由基的能力相比，隨著質量濃度增大，二者無顯著差異（P＞0.05），表明輔料的添加和制劑過程并不影響花色苷的抗氧化性。

圖9 在不同質量濃度下三種抗氧化劑ABTS自由基清除率的對比

3 結論

以黑果腺肋花楸果粉為主料，制備黑果腺肋花楸花色苷咀嚼片，其最佳配方為果粉34%、β-環糊精11%、甘露醇16%、檸檬酸3%、花色苷20%，在此工藝條件下咀嚼片具有較好的口感。并通過質構儀對最佳工藝下的咀嚼片進行測定，與市面上的VC咀嚼片作為對照，結果顯示其具有較為適宜的硬度和咀嚼性。此外，對其抗氧化性進行研究，其抗氧化性優于同樣高濃度的VC咀嚼片，略低于花色苷，表明其具有較好的抗氧化性能。