低共熔溶劑協同酸性二氧六環預處理楊木及其酶水解特性的探究

徐春燕，熊鳳，陳德明，單玉蓉，張林，王揮

(1.中南林業科技大學 材料科學與工程學院，湖南 長沙 410000；2.國家林業局生物乙醇研究中心，湖南 長沙 410000； 3.湖南省木質資源定向轉化國際聯合實驗室，湖南 長沙 410000)

木質纖維是一種豐富的可再生資源，可通過酶的水解糖化進一步轉化為生物燃料和糖基化學品[1]。楊木作為一種速生豐產樹種，是一種極具潛力的生物質能源[2]。但楊木中緊密的三維結構阻礙了對纖維素的利用，因此需在水解之前對其進行一定的預處理[3-4]。

低共熔溶劑(DES)作為離子液體的一種相似溶劑，具有來源廣泛、易于回收、環境友好等優點[5-8]。在1，4-二氧六環溶液中加入酸催化劑，H+可以裂解生物質內部的分子鍵，對生物質預處理有著良好的效果[9]。本研究采用DES協同酸性二氧六環對楊木進行預處理，優化了協同預處理楊木的工藝條件。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

楊木碎屑(80目)；纖維素酶(濾紙酶活為 50 FPU/g)，由白銀賽諾生物科技有限公司提供；氯化膽堿、1，4-二氧六環、乙酸、鹽酸均為分析純。

KF-20流水式粉碎機；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；760R恒溫搖床；Bruker D8 Advance X射線衍射儀；Thermo Scientific Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜儀；Zeiss Sigma 300掃描電鏡；TGA5500熱重分析儀；Thermo Scientific K-Alpha XPS能譜儀；LC-16C高效液相色譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 氯化膽堿/乙酸DES的制備 常溫下分別稱取一定量的氯化膽堿和乙酸(氯化膽堿與乙酸的摩爾比為1∶2)于厚壁耐壓瓶中，密封的耐壓瓶，置于油浴鍋中，不斷攪拌，加熱至80 ℃，保溫2 h，直至形成混合均一的透明液體。冷卻至室溫后，放入真空干燥箱內保存待用。

1.2.2 楊木預處理 250 mL三頸燒瓶中加入楊木5 g，濃度1%的HCl溶液，50 mL的DES溶液和 50 mL 的1，4-二氧六環溶液，混合均勻，磁力攪拌，油浴加熱，反應儀器配備冷凝減壓裝置。在120 ℃反應 80 min。反應結束后冷卻至室溫，真空抽濾，用無水乙醇與去離子水的混合溶液(1∶2體積比)洗滌，直至濾液澄清無色，干燥后封存于密封袋中備用。

濾液通過旋轉蒸發儀分離回收液體；保存分離出DES后上層黏液部分，用于后續循環使用。

1.2.3 纖維素酶水解 分別稱取1 g楊木原料和預處理后的楊木殘渣于100 mL錐形瓶中，各加入50 mL的檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=4.8)和纖維素酶(用量30 FPU/g)，搖勻，置于恒溫搖床中，在溫度50 ℃，轉速180 r/min的條件下酶解72 h。

1.3 分析測定

1.3.1 物料組分測定 參照美國可再生能源實驗室(NREL)的分析方法測定楊木原料和預處理后楊木殘渣中纖維素、半纖維素和木質素的含量。固體得率、纖維素保留率、半纖維脫除率和木質素脫除率分別按式(1)～式(4)計算。

(1)

(2)

(3)

(4)

式中M1——預處理后殘渣質量，g；

M0——預處理前物料質量，g；

WC0、WH0和WL0——分別為預處理前物料中纖維素、半纖維素和木質素質量分數，%；

WC1、WH1和WL1——分別為預處理后殘渣中纖維素、半纖維素和木質素質量分數，%。

1.3.2 糖含量測定 采用高效液相色譜儀分析酶水解液中葡萄糖含量，配備Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm)。進樣量為20 μL，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫為45 ℃，采用示差折光檢測器。葡萄糖水解得率按式(5)計算。

(5)

式中C——水解液中葡萄糖質量濃度，g/L；

V——水解糖液體積，L；

M——原料質量，g；

W——原料中纖維素質量分數，%。

1.3.3 固形物的定性分析 通過X射線衍射(XRD)、紅外光譜(FTIR)、掃描電鏡(SEM)和熱重分析(TG)等方法，對楊木原料和最優工藝條件下的預處理殘渣進行分析。

1.3.3.1 XRD分析 通過X射線衍射儀對預處理前后楊木進行分析，采用Cu靶，測定電壓為40 kV，電流40 mA，掃描范圍10～80°，掃描速率為 10 (°)/min。纖維素結晶度(CrI)根據式(6)計算。

(6)

式中I002——在002晶格處的衍射峰強度；

Iam——在無定型區背景衍射的散射強度。

1.3.3.2 FTIR分析 采用傅里葉變換紅外光譜儀對楊木和預處理殘渣進行表征，波數范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.3.3 SEM分析 使用掃描電鏡對樣品形貌進行分析，操作電壓為2 kV。

1.3.3.4 TG分析 使用熱重分析儀分析樣品的熱穩定性。在氮氣氣氛下，以升溫速率10 ℃/min從30 ℃升溫至800 ℃，觀察樣品質量隨溫度的變化情況。

1.3.3.5 XPS分析 采用XPS能譜儀測試樣品的光電子能譜，工作電壓為12 kV，燈絲電流為6 mA。全譜掃描通能為100 eV，步長1 eV；窄譜掃描通能為50 eV，步長0.05 eV。

2 結果與討論

2.1 預處理單因素實驗

2.1.1 鹽酸濃度對楊木組分及酶解得率的影響 結果見圖1。

圖1 鹽酸質量分數對楊木預處理效果的影響Fig.1 Affect of HCl concentration on pretretment effect of poplar

由圖1可知，隨著鹽酸質量分數的增大，半纖維素和木質素的脫除率均呈現緩慢上升的趨勢。鹽酸質量分數為1%時，半纖維素的脫除率達到70.27%，木質素的脫除率達到50.64%。相對應的，葡萄糖得率呈現出先緩慢上升后下降的趨勢，并在鹽酸質量分數為1%時達到最大值。鹽酸在預處理的反應中起到酸性催化劑的作用，H+可以裂解生物質大分子中的木質素、半纖維素和木質素-碳水化合物復合體，使得大量木質素和纖維素溶解到反應溶液中。這一過程解離了生物質原料楊木的致密結構，暴露了纖維素的活性位點，增加了纖維素酶可及的表面積，使纖維素酶的水解更高效[10]。

2.1.2 反應溫度對楊木組分及酶解得率的影響 結果見圖2。

由圖2可知，預處理溫度對半纖維素和木質素的脫除效率影響顯著。當反應溫度從60 ℃提高至140 ℃，木質素脫除率由11.77%升至58.69%，半纖維素的脫除率更是由10.64%升至67.52%。表明適當提高預處理溫度，對木質素和半纖維素的脫除有著積極的促進作用。隨著預處理溫度的升高，葡萄糖得率呈現上升趨勢，在120 ℃條件下葡萄糖得率最高；溫度繼續升高，葡萄糖得率開始逐漸下降，這可能是由于過高的溫度會破壞楊木中纖維素的結構，使纖維素含量減少[11]。

圖2 溫度對楊木預處理效果的影響Fig.2 Affect of temperature on pretreatment effect of poplar

2.1.3 反應時間對楊木組分及酶解得率的影響 結果見圖3。

圖3 反應時間對楊木預處理效果的影響Fig.3 Affect of reaction time on pretreatment effect of poplar

由圖3可知，隨著預處理時間的延長，半纖維素和木質素的脫除率均呈現出緩慢上升的趨勢。在實驗范圍內，纖維素的保留率一直保持在70%左右，表明該預處理方式未導致纖維素過多的損失。葡萄糖得率也隨著預處理時間的適當延長而增加，在 80 min 時，葡萄糖得率達到最大值(64.15%)；溫度繼續升高，葡萄糖得率開始緩慢下降，這可能是由于隨著預處理時間的延長，反應過程中溶出的木質素在該溶劑體系中發生團聚，從而影響了纖維素酶的可及性，因而導致葡萄糖得率下降[12]。時間因素對葡萄糖得率的影響與纖維素保留率趨勢一致。

在一定范圍內，溫度的升高和時間的延長對葡萄糖的得率有明顯的促進作用；但預處理溫度過高或預處理時間過長，葡萄糖得率開始減少。這主要是因為半纖維素是雜多糖，在一定條件下(高溫、高酸等)會發生二次水解，產生糠醛等抑制物，從而對纖維素酶的水解產生抑制作用[13]。

2.2 正交實驗結果

根據單因素實驗得出的最佳實驗條件，設計正交實驗對其進行進一步優化，結果見表1。

由表1可知，協同預處理楊木的最優實驗條件為A2B1C1，即鹽酸質量分數1%，預處理溫度 110 ℃，預處理時間70 min。以該條件進行驗證實驗，結果見表2。

表1 協同預處理楊木正交實驗Table 1 Incomplete factorial experimental design of poplar with synergistic pretreatment

楊木酶水解葡萄糖得率達到了69.75%，纖維素保留率為73.66%，木質素和半纖維素脫除率分別為48.71%和72.61%。

表2 不同預處理方法對楊木組分及葡萄糖得率的影響Table 2 Effects of different pretreatment methods on the components and glucose yield of poplar

由表2可知，原料楊木的酶水解得率20.68%，經過DES單獨預處理楊木的葡萄糖得率為 29.24%，僅有較小幅度的提高。采用協同預處理，使纖維素酶解得率73.66%得到了大幅度的提升，葡萄糖得率達到了69.75%，表明該協同預處理是一種高效的預處理工藝。

2.3 協同預處理對樣品結構形態的影響

2.3.1 XRD分析 對最佳工藝條件下預處理的楊木、經過酶解之后的樣品和楊木原料進行XRD分析，結果見圖4。

由圖4可知，所有樣品的衍射峰型相似，說明預處理以及酶水解未改變纖維素的晶型，只是導致了特征峰強度的變化。根據峰高法計算結晶度可得[14]，原料、預處理后和酶解后樣品結晶度分別為34.91%，60.08%和64.40%，預處理以及酶解后樣品的結晶度都有了大幅度升高。這說明預處理脫除了楊木中的部分木質素和半纖維素，纖維素組分的含量相對增加，從而使預處理后的樣品結晶度增加[6]。經過酶水解之后，纖維素結晶度增加到 64.40%，這是由于纖維素酶打破部分結晶區表面分子鏈的致密結構，使得纖維素分子無序性增加，形成新的無定型區，因此纖維素結晶度隨著酶水解的進行而增加是合理的[15]。

圖4 不同樣品的XRD圖Fig.4 XRD patterns of samples a.楊木原料；b.預處理后樣品；c.酶解后樣品 I002是結晶區約在2θ=22.5°處峰的強度， Iam是無定型區域約在2θ=18.0°處峰的強度

2.3.2 FTIR分析 圖5是三種樣品的紅外光譜圖。

圖5 不同樣品的FTIR圖Fig.5 FTIR patterns of samples a.楊木原料；b.預處理后樣品；c.酶解后樣品

2.3.3 熱重(TG)分析 不同樣品的熱重分析結果見圖6。

由圖6可知，預處理及酶解過程會使原料的熱穩定性發生改變。當溫度<200 ℃時，主要是樣品內部的水分蒸發，未發生明顯的熱失重變化。在200～400 ℃間，原料和預處理后的樣品開始迅速分解，此階段主要是纖維素和半纖維素的熱解。木質素的熱降解始于400 ℃以后[17]。預處理后的樣品在380 ℃降解速率緩慢，且逐漸接近恒定質量，固體殘留質量高于相同溫度下原料對應的殘留質量。這是由于本實驗選用鹽酸作為酸性催化劑，反應過程中容易使楊木原料發生碳化，所以最終的殘碳含量更高。酶解后樣品的熱失重曲線發生了較為明顯的變化，說明酶水解顯著破壞了生物質分子結構。

圖6 不同樣品的TG圖Fig.6 TG patterns of samples a.楊木原料；b.預處理后樣品；c.酶解后樣品

2.3.4 SEM分析 預處理前后以及酶解后楊木的掃描電鏡觀察，結果見圖7。

圖7 不同樣品的掃描電鏡圖Fig.7 SEM patterns of samples a.楊木原料；b.預處理后樣品；c.酶解后樣品

由圖7可知，楊木原料表面光滑，生物結構排列整齊。經過協同預處理后，楊木表面出現裂縫和碎片，表面變得粗糙。樣品表面變得更加疏松，使得更多的纖維素暴露在外，這能夠為后續的酶解反應提供更多的反應位點，增加了纖維素酶對楊木原料中纖維素的可及性[18]。值得注意的是，楊木表面出現的大量凹陷和裂痕在一定程度上提高了樣品的比表面積。這些因素共同促進了纖維素酶的酶解反應，因而提高了葡萄糖得率。

2.3.5 X射線光電子能譜分析[19]不同楊木樣品的XPS圖譜見圖8。

圖8 不同樣品的XPS圖譜分析Fig.8 XPS analysis of different samples a.楊木原料；b.預處理后樣品；c.酶解后樣品

由圖8可知，通過高斯-洛倫茲擬合將XPS-C 1s區分為三個小峰，分別代表了木質生物質中與不同原子或原子團結合的碳；C1主要來源于木質素和抽提物，C2主要來源于半纖維素和纖維素中的羥基基團，C3主要存在于半纖維素和木質素中的羰基基團[20]。

表3為不同樣品的O/C原子比以及C1～C3峰的相對含量。通常來說，O/C原子比越高，表明樣品中的纖維素或半纖維素比例越高，而O/C原子比低則表明樣品木質素含量較高。

表3 不同樣品的氧碳原子比及C 1s峰的解析Table 3 Atomic O/C ratios and C 1s peak deconvolution of different samples

由表3可知，楊木經過預處理之后，C1峰值強度由16.93%升至46.91%，C3峰值強度由55.01%降至9.62%，這說明樣品中的半纖維素被去除[21]。預處理后O/C原子比值為0.37，略低于原料(0.40)，這可能是由于隨著反應時間的延長，反應溶出的木質素在樣品表面再沉積所致[22]。酶解后O/C原子比值分別都高于原料和預處理后的樣品，說明此時樣品木質素含量較低，纖維素含量較多，這是由于在酶水解過程中去除了樣品表面沉積的木質素，進一步證實了協同預處理對木質素和半纖維素的脫除作用。

3 結論

以楊木為原料，采用低共熔溶劑協同酸性二氧六環預處理的最佳條件為：鹽酸質量分數為1%，預處理溫度為110 ℃，預處理時間為70 min。在最佳預處理條件下，纖維素保留率為73.66%，木質素和半纖維素脫除率分別為48.71%和72.61%；楊木的酶解得率可達69.75%。