肝細(xì)胞癌組織Foxj2、PCDH20的表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

馬慧發(fā),王劭煒,楊士民

(1.天津市天津醫(yī)院 普通外科,天津300200;2.天津市南開(kāi)醫(yī)院 胃腸外科,天津300100)

肝癌在2018年全球惡性腫瘤流行病學(xué)調(diào)查中居發(fā)病率第7位、死亡率第3位[1]。我國(guó)肝癌的發(fā)病率和死亡率分別為26.92/10萬(wàn)和23.72/10萬(wàn)，居惡性腫瘤發(fā)病率第4位、死亡率第2位，其中肝細(xì)胞癌(HCC)在原發(fā)性肝癌中占比85%-90%，嚴(yán)重威脅人民生命健康[2]。近年來(lái)，有學(xué)者通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠肝癌細(xì)胞內(nèi)叉頭框蛋白J2(Foxj2)基因?qū)mad2、Smad4等基因表達(dá)有抑制作用，從而對(duì)肝癌細(xì)胞增殖進(jìn)行抑制[3]。另有研究提示原鈣黏蛋白-20(PCDH20)是非成簇原鈣黏蛋白的重要組成部分，其調(diào)節(jié)功能廣泛，在神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖與凋亡中均有調(diào)節(jié)作用，且與鼻咽癌、肺癌等惡性腫瘤有關(guān)[4]。本研究擬分析Foxj2、PCDH20在HCC組織中的表達(dá)情況，探討二者與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入天津市天津醫(yī)院2013年5月-2016年5月收治的HCC患者83例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)手術(shù)(肝癌根治性切除術(shù))切除標(biāo)本病理檢查證實(shí)為HCC者，年齡>18歲；首次確診的患者；未見(jiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；術(shù)前血常規(guī)、AFP、腹部超聲、CT或MRI等檢查完善者；具備手術(shù)指征，均完成手術(shù)者；自愿簽署知情同意書(shū)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：患免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)疾病者；入院前近6個(gè)月內(nèi)有大手術(shù)史者；患其他部位的原發(fā)性腫瘤者；患嚴(yán)重心腦血管疾病者(例如心肌梗死、腦梗死等)；有精神障礙史者。

其中男48例，女35例，年齡34-70歲，平均(55.29±12.24)歲；TNM分期：T1期18例，T2期35例，T3a期30例；乙肝表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性48例，陰性35例；Child-Pugh分級(jí)：A級(jí)55例，B級(jí)28例。研究方案獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1檢測(cè)方法 采用免疫組化法測(cè)定HCC組織、癌旁組織(距離腫瘤3-5 cm)中Foxj2、PCDH20表達(dá)情況。DAB顯色試劑、中性樹(shù)膠、Foxj2多克隆抗體、PCDH20多克隆抗體，均購(gòu)于上海科敏生物科技有限公司。

1.2.2檢測(cè)結(jié)果評(píng)估 免疫組化結(jié)果分析[5]：由2名高資質(zhì)的病理科醫(yī)生采用雙盲法閱片，在高倍視野(×200)下觀察切片染色情況，以出現(xiàn)棕黃、棕褐色顯色提示為陽(yáng)性細(xì)胞。染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色、淺黃、棕黃、棕褐色分別計(jì)0、1、2、3分。陽(yáng)性細(xì)胞占比計(jì)分：<1%、1%-25%、25%-50%、50%-75%、≥75%分別計(jì)0、1、2、3、4分。二者乘積為最終染色計(jì)分結(jié)果，0-2分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。

1.2.3血常規(guī)、AFP及HBsAg檢查 在患者入院當(dāng)日，采集4 ml肘靜脈血分裝為兩管，其中一管離心10 min(轉(zhuǎn)速3 000 r/min,半徑11 cm)，分離血清，存至-80℃下備用；另一管不做離心處理，加入抗凝劑，以相同條件保存?zhèn)溆谩２捎没瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)血清AFP水平，試劑盒購(gòu)自深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司；采用BC-6800Plus全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)測(cè)定血小板計(jì)數(shù)(PLT)、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(NLR)；通過(guò)化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定HBsAg，試劑購(gòu)自日本希森美康株式會(huì)社。

1.3 隨訪跟蹤

隨訪時(shí)間為5年，以患者術(shù)后第1 d為起始日，隨訪截止時(shí)間為2021年5月，隨訪方式根據(jù)患者的實(shí)際情況選擇，包括門(mén)診隨訪、電話隨訪、微信隨訪。記錄患者術(shù)后5年累積生存時(shí)間，累積生存時(shí)間即術(shù)后第1 d至死亡的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

經(jīng)SPSS20.0軟件行數(shù)據(jù)分析。以百分比(%)表示計(jì)數(shù)資料，行χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗(yàn)分析不同F(xiàn)oxj2、PCDH20表達(dá)患者的無(wú)瘤生存率與累積生存率。利用Spearman相關(guān)性分析Foxj2、PCDH20表達(dá)的相關(guān)性。經(jīng)COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析HCC患者的預(yù)后影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織、癌旁組織中Foxj2、PCDH20表達(dá)比較

HCC組織中Foxj2、PCDH20陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 HCC組織癌旁組織中Foxj2、PCDH20表達(dá)比較[n(%)]

2.2 HCC患者Foxj2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)Foxj2表達(dá)情況將患者分為Foxj2陰性組、Foxj2陽(yáng)性組。Foxj2陰性組臨床分期T3a期、門(mén)靜脈癌栓、多發(fā)腫瘤(經(jīng)肝癌根治性切除術(shù)后檢查證實(shí))、HBsAg陽(yáng)性、低分化、腫瘤直徑≥5 cm人數(shù)占比高于陽(yáng)性組(P<0.05)，兩組性別、年齡、術(shù)前PLT、術(shù)前NLR、術(shù)前AFP、Child-Pugh分級(jí)比較無(wú)差異(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 HCC患者Foxj2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 HCC患者PCDH20表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

PCDH20陰性組臨床分期T3a期、門(mén)靜脈癌栓、多發(fā)腫瘤、HBsAg陽(yáng)性、低分化、腫瘤直徑≥5 cm人數(shù)占比高于陽(yáng)性組(P<0.05)，兩組性別、年齡、術(shù)前PLT、術(shù)前NLR、術(shù)前AFP、Child-Pugh分級(jí)比較無(wú)差異(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 HCC患者PCDH20表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 不同F(xiàn)oxj2、PCDH20表達(dá)患者的預(yù)后比較

隨訪5年，在83例患者中，有8例失訪。Foxj2陰性組的累積生存率為21.15%(11/52)，F(xiàn)oxj2陽(yáng)性組的累積生存率為52.17%(12/23)；Foxj2陰性組累積生存率低于陽(yáng)性組(Log-rankχ2=4.869，P=0.027)。PCDH20陰性組累積生存率為21.82%(12/55)，PCDH20陽(yáng)性組累積生存率為55.00%(11/20)；PCDH20陰性組累積生存率低于陽(yáng)性組(Log-rankχ2=4.486，P=0.034)。具體生存曲線圖見(jiàn)圖1-2。Spearman相關(guān)分析提示HCC患者Foxj2與PCDH20表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.624，P<0.001)。

圖1 不同F(xiàn)oxj2表達(dá)患者的累積生存曲線圖

2.5 HCC患者預(yù)后的COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析

將相關(guān)變量納入COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，以HCC患者預(yù)后為因變量X(生存=0，死亡=1)，結(jié)果提示臨床分期T3a期、門(mén)靜脈癌栓、低分化是預(yù)后的危險(xiǎn)因素，而Foxj2、PCDH20陽(yáng)性表達(dá)是預(yù)后的保護(hù)因素(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 HCC患者預(yù)后的COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析

3 討論

HCC是較常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，目前，手術(shù)切除仍是治療HCC的主要方式，隨著臨床診療技術(shù)的進(jìn)步，外科手術(shù)方案較過(guò)去已取得了較大進(jìn)展，但總體生存率仍不理想，據(jù)既往研究報(bào)道HCC術(shù)后1年、3年、5年的生存率分別為85.5%、66.7%、20.7%[6-7]。

圖2 不同PCDH20表達(dá)患者的累積生存曲線圖

近年來(lái)，研究指出肝癌致病原因復(fù)雜，涉及到環(huán)境、遺傳、慢性肝炎、細(xì)菌感染等多種因素，上述因素可能通過(guò)影響肝細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致相關(guān)基因、蛋白表達(dá)出現(xiàn)異常改變，參與腫瘤進(jìn)展[8-9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Foxj2能對(duì)肝癌小鼠的HepG2細(xì)胞體外增殖進(jìn)行抑制，并可抑制腫瘤生長(zhǎng)[10]。另有研究認(rèn)為PCDH20對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有調(diào)控作用，可發(fā)揮抑癌功能[11]。

Foxj2是叉頭框蛋白家族的一員，在非小細(xì)胞肺癌組織中Foxj2陽(yáng)性表達(dá)低于癌旁組織，它可通過(guò)調(diào)節(jié)鈣黏蛋白基因轉(zhuǎn)錄影響細(xì)胞浸潤(rùn)、遷移[12]。另有研究指出Foxj2在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)下調(diào)，其過(guò)表達(dá)能對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行抑制，而將其敲除，則可促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展，這表明Foxj2可能通過(guò)調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮作用，這可能是Foxj2在腫瘤中的一種作用機(jī)制[13]。PCDH20是非成簇原鈣黏蛋白的重要組成部分，生物功能非常廣泛，在神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)傳導(dǎo)中有調(diào)節(jié)作用，具有抑癌功能，其異常表達(dá)對(duì)肝癌患者耐藥性有較大影響，PCDH20表達(dá)降低，可導(dǎo)致肝癌患者對(duì)5-氟尿嘧啶的耐藥性增強(qiáng)，其過(guò)表達(dá)則能使肝癌耐藥性降低，這提示PCDH20在肝癌中發(fā)揮抑癌作用[14]。Foxj2、PCDH20在HCC中均具有抑癌作用，二者在HCC組織中表達(dá)下調(diào)可能與患者自身的癌細(xì)胞增殖過(guò)快，機(jī)體抗癌作用下降有關(guān)。

HCC患者的臨床病理特征復(fù)雜，其病理表現(xiàn)的復(fù)雜性可能與相關(guān)癌基因、蛋白的表達(dá)相關(guān)[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCC患者Foxj2、PCDH20表達(dá)與臨床分期、門(mén)靜脈癌栓、腫瘤數(shù)目、分化程度及腫瘤直徑有關(guān)。Foxj2、PCDH20在肝癌中發(fā)揮抑癌作用，二者陰性表達(dá)提示抑癌作用削弱，導(dǎo)致HCC患者病情進(jìn)一步進(jìn)展，臨床分期增高，分化程度降低，腫瘤體積增大，增加了門(mén)靜脈癌栓以及多發(fā)性腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究顯示Foxj2、PCDH20陰性表達(dá)HCC患者5年累積生存率較陽(yáng)性患者降低，二者呈正相關(guān)且陽(yáng)性表達(dá)是患者預(yù)后的保護(hù)因素。Foxj2可能通過(guò)對(duì)E-鈣黏蛋白基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，從而調(diào)節(jié)癌細(xì)胞浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移[16]，而PCDH20在HCC中可能通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路產(chǎn)生抑癌作用[17]。Foxj2、PCDH20在肝癌中均具有重要調(diào)控作用，二者的陰性表達(dá)能促進(jìn)肝癌進(jìn)展，可能通過(guò)調(diào)控與肝癌相關(guān)的信號(hào)通路或因子，共同影響肝癌患者病情。

綜上所述，HCC組織中Foxj2、PCDH20的陰性表達(dá)率較高，二者陰性表達(dá)會(huì)降低患者5年累積生存率，導(dǎo)致預(yù)后不良。