circRNA在糖尿病腎病中的研究進展

俞元植，尹 敏，陳佳琦，劉 鋒

(吉林大學中日聯誼醫院 腎病內科，吉林 長春130033)

腎臟在糖尿病作用下，易發生纖維化，影響腎臟正常功能，導致糖尿病腎病(DKD)，并最終發展成終末期腎臟病(ESRD)。因此預防和延緩DKD進展對減少ESRD的發生至關重要。多項研究表明環狀RNA(circRNA)參與DKD形成的多種機制，可能是DKD發病過程中的重要因子。因此本文將對circRNA與DKD的關系進行綜述。

1 circRNA概述

1.1 circRNA的形成及分類

circRNA是一種新型的非編碼RNA，近年來受到越來越多的關注[1]。circRNA主要來源于蛋白質編碼的外顯子。但也可以來自基因組的內含子、未翻譯區域或基因間隔區[2]。根據形成方式和序列的不同，circRNA可分為外顯子circRNA(ecircRNAs)、內含子circRNA(ciRNAs)以及外顯子和內含子共同組成的circRNA(EIciRNAs)[3-5]。目前較為明確的成環機制是ecircRNAs的兩種成環模型：一是直接反向剪接即內含子配對環化，二是外顯子跳躍即套索驅動環化[3]。此外還有ciRNAs形成模型，以及RNA結合蛋白(RBPs)或反式因子(trans-factors)驅動的RNA環化模型[4,6]。

1.2 circRNA的特點

circRNA沒有5’帽與3’多聚腺苷尾，可以在一定程度上抵抗RNA核酸外切酶或核糖核酸酶的降解，因此具有高度穩定性。同時，相對于circRNA相關的線性mRNA而言，circRNA半衰期稍長[7]。有研究顯示，在某些類型的細胞中，circRNA的表達能力較弱。而另一些研究表明其與相對應的線性異構體的豐度相當或數倍[2-3]。關于circRNA表達豐度的研究差異可能由于細胞類型特定或組織特定的表達模式[8]。此外，circRNA在物種間的表達方式和序列均高度保守[6]。這些特性使得circRNA有望成為人類疾病的候選生物標記。

1.3 circRNA的功能

海綿吸附miRNA(mircoRNA)：帶有miRNA結合位點的circRNA可作為競爭性內源RNA(ceRNA)，阻礙miRNA與mRNA的反應，影響miRNA的活性，提高miRNA靶標的表達能力[9-10]。

與蛋白質相互作用：circRNA與RNA結合蛋白(RBPs)結合，作為支架促進蛋白質復合體的形成和反應[11-12]。如circPABPN1和HuR的結合抑制了HuR和PABPN1mRNA的結合，降低PABPN1的轉錄水平[13]。circ-Foxo3與細胞周期蛋白依賴性激酶 2(CDK2)和CDKA1或細胞周期蛋白激酶抑制劑(p21)結合，形成三元復合體，使細胞周期停滯[14]。

調節轉錄：研究表明，一些源自反向剪接(具有保留的內含子)或加工過的內含子套索的circRNA保留在細胞核[4-5]。如通過與U1小核糖核蛋白(U1snRNR)相互作用或正向調節RNA聚合酶Ⅱ，EIciEIF3J和EIciPAIP2可以促進親本基因的轉錄。而EIciEIF3J和EIciPAIP2的表達下調，EIF3J和PAIP2基因的轉錄水平也下調[5]。circRNA既可以增加線性RNA的轉錄，也可以抑制其轉錄。外顯子形成的 circRNA 在RNA合成與經典剪接的互相競爭中有重要作用。

參與翻譯：circRNA可通過帽子非依賴方式進行轉錄。包含無限閱讀框的circRNA可模擬原核生物的RNA翻譯模式，以實現DNA滾環擴增[15]。翻譯可以通過含有細胞內核糖體插入部位(IRES)的circRNA來完成,或由N6-甲基腺苷化修飾(6mA or m6A)circRNA發生[16-17]。

2 circRNA在DKD腎纖維化發生中的機制

腎纖維化以腎小球硬化、腎小管間質纖維化為主要特征。本質上是細胞外基質(ECM)過度沉積。同時，上皮細胞-間充質轉化(EMT)和外泌體(Exosome)也在腎纖維化過程中扮演著重要角色。

2.1 circRNA與腎小球系膜細胞

在高糖(HG)處理后的腎小球系膜細胞(GMC)中，circLRP6、circHIPK3、circ_0037128、circ-ACTR2、circ_0000064、circTLK1、circ-GNB4表達增加，通過GMC增殖、氧化應激、炎癥、ECM積聚等不同方式，促進DKD進展。

circLRP6海綿吸附miR-205，上調HMGB1和激活TLR4/核因子-κB(NF-κB)通路來調節GMC增殖、氧化應激、ECM沉積和炎癥[18]。circHIPK3通過海綿吸附miR-185，增加GMC中細胞周期蛋白D1(cyclin D1)、增殖細胞核抗原(PCNA)、促進轉化生長因子-β1(TGF-β1)、Ⅰ型膠原蛋白(Collagen typeⅠ)，纖連蛋白(FN)的mRNA 豐度，促進細胞增殖[19]。Wang等[20]發現circ_0037128通過miR-17-3p調節AKT3表達，刺激細胞增殖和纖維化。circ-ACTR2、circ_0000064、circ-GNB4分別通過miR-205-5p/高遷移率族蛋白A2(HMGA2)軸、miR-424-5p/WNT2B軸、circ-GNB4/miR-23c/EGR1軸促進細胞增殖、炎癥和ECM沉積和氧化應激[21-23]。而circTLK1則可通過海綿吸附miR-126-5p/miR-204-5p阻斷AKT/NF-κB通路以促進炎癥、氧化應激和ECM沉積，加重腎臟纖維化[24]。

2.2 circRNA與足細胞

炎癥誘導的足細胞(podocyte)損傷是腎小球纖維化、硬化和進行性腎功能喪失的主要原因[25]。

circ_0000285通過海綿吸附miR-654-3p 和激活MAPK6，釋放白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子，促進足細胞損傷[26]。Fang等[27]發現hsa_circ_0037128通過調節miR-31-5p/ Kruppel樣轉錄因子9(KLF9)軸促進足細胞損傷。

2.3 circRNA與腎小管上皮細胞

在HG處理后的腎小管上皮細胞中，circRNA_010383表達減少，可抑制腎小管間質纖維化；circ_0037128、circEIF4G2、circ_0000064表達增加，則加重纖維化。

在體外，circRNA_010383過表達，通過海綿吸附miR-135a，抑制ECM蛋白沉積，并上調miR-135a的靶蛋白，瞬時受體電位陽離子通道亞家族C成員1(TRPC1)的表達，負性調節ECM沉積和腎纖維化。在體內，circRNA_010383過表達可抑制蛋白尿和腎臟纖維化，從而延緩DKD進展[28]。

circ_0037128/miR-497-5P/活化T-細胞核因子(NFAT5)軸、circ_0000064/miR-532-3p/ROCK軸均參與促進腎小管上皮細胞增殖、氧化應激、炎癥和纖維化[29-30]。circEIF4G2通過miR-218/SERBP1軸，TGF-β1、ColⅠ和FN的表達增加，促使腎小管上皮細胞纖維化[31]。

2.4 circRNA與外泌體

外泌體是一種直徑為40-100 nm，包含了DNA、RNA 和蛋白質的信息傳遞器。外泌體是circRNA的重要載體。在DKD進展中起重要作用，可以作為DKD腎纖維化治療靶點[32-33]。

Li等[34]發現經HG 處理的腎小球上皮細胞(GEC)外泌體中circTAOK1(circ_0003928)表達上調。GEC-circTAOK1-Exo海綿吸附miR-520h并調節SMAD表達，促進GMC增殖、纖維化和EMT。外泌體circRNF169和circSTRN3可促進α-SMA表達，上調或下調circRNF169和circSTRN可分別有效抑制或促進細胞增殖、EMT，從而抑制或促進DKD進展[35]。HG處理后的GMC中分離的外泌體中，外泌體circ_DLGAP4、circ_0125310增加。且eco-circ_ DLGAP4、exo-circ_0125310能顯著促進GMC增殖及纖維化。進而發現circ_DLGAP4通過海綿化miR-143和調節Erb-b2受體酪氨酸激酶3(ERBB3) /NF-κB/基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)軸促進GMC的增殖和纖維化。隨后的體內測定證明circ_DLGAP4過表達后可調節miR-143/ERBB3/NF-κB/MMP-2，促進DKD進展[36]。circ_0125310海綿吸附miR-422a上調IGF1R/p38的表達水平，且體內測定顯示circ_0125310表達過度可促進DKD進展。證明exo-ciec_0125310通過海綿吸附miR-422a，靶向IGF1R/P38軸，促進細胞增殖和纖維化[37]。

2.5 circRNA與上皮細胞-間充質轉化

EMT是指通過特定的程序將上皮細胞轉化為間質表型細胞的生物過程。主要特征有細胞黏附分子表達減少、細胞骨架以細胞角蛋白細胞骨架轉化后的波形蛋白(Vimentin)為主。

在HG誘導的小鼠GMC中，circ_0000491水平升高。敲除circ_0000491則可減少vimentin、FN和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)以及Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白(collagen typeⅠ、Ⅲ、Ⅳ，ColⅠ、Ⅲ、Ⅳ)，同時增加GMC中E-鈣黏蛋白(e-cadherin)，起到抑制EMT的作用。circRNA_0000491/miR-101b/TGFβRI軸可通過調控EMT，促進DKD進展[38]。

因此可以嘗試通過影響作用于GMC、足細胞、腎小管上皮細胞的circRNA，外泌體circRNA以及調控EMT的circRNA，改變DKD的腎臟損害程度。通過上述circRNA，可以進一步了解腎臟纖維化，并為延緩DKD進展提供新思路。

3 circRNA在DKD細胞程序性死亡中的機制

3.1 circRNA與凋亡

凋亡是由基因控制的細胞自主、有序死亡。在HG處理后的GMC中，circ_0000712、circ_0000491、circ-FBXW12過表達，而circ-AKT3、circ_LARP4、circSMAD4表達降低。

circ_0000712、circ_0000491分別通過miR-879-5p/SOX6軸、miR-455-3p/Hmgb1軸促進細胞凋亡、炎癥、氧化應激和纖維化[39-40]。降低circ-FBXW12可通過miR-31-5p/LIN28B軸抑制HG誘導HMC中的細胞增殖、細胞周期停滯、ECM產生和氧化應激，從而延緩DKD進展[41]。

circ-AKT3、circ_LARP4過表達抑制纖維化相關蛋白的水平，如FN、ColⅠ和ColⅣ，且抑制GMC凋亡。circ-AKT3通過調節miR-296-3p/E-cadherin信號抑制ECM沉積，從而延緩DKD的發展[42]。circ_LARP4可促進BAX的表達，降低Bcl-2的表達。這說明circ_LARP4的過度表達對細胞增殖有抑制作用，使細胞凋亡率增高。在DKD細胞模型中circ_LARP4低于正常細胞，circ_LARP4 過表達導致細胞增殖和細胞纖維化減少，但通過海綿化miR-424在DKD細胞中增加細胞凋亡[43]。circSMAD4過表達可通過miR-377-3p/BMP7軸減輕細胞炎癥、ECM沉積和細胞凋亡，延緩DKD進展[44]。

HG處理后的腎小管上皮細胞中，circ_0041795、hsa_circ_0003928、circ_0003928、circ_0060077、circ_000166、circ_WBSCR17表達上調，促進細胞凋亡；而circHIPK3表達下調，抑制細胞凋亡。

沉默circ_0041795通過靶向上調miR-361-3p可減弱腎小管上皮細胞凋亡和氧化應激損傷[45]。hsa_circ_0003928、circ_0003928分別通過miR-151-3p/膜聯蛋白A2(Anxa2)軸、miR-506-3p/HDAC4軸促進炎癥和細胞凋亡[46-47]。降低circ_0060077表達可通過miR-145-5p/VASN軸保護腎小管上皮細胞[48]。circ_000166、circ_WBSCR17分別通過miR-296/SGLT2軸、miR-185-5p/SOX6 軸促進腎纖維化和細胞凋亡[49-50]。

circHIPK3通過miR-326/miR-487a-3p/沉默信息調節因子2相關酶1(SIRT1)SIRT1軸可減輕HG對腎小管上皮細胞的毒性作用，抑制其增殖和凋亡，減少炎性細胞因子的分泌，延緩DKD進展[51]。

3.2 circRNA與焦亡

焦亡又稱細胞炎性壞死，是程序性細胞死亡的一種，表現為細胞不斷膨脹，直至細胞膜破裂，引起細胞內容物的釋放，繼而激活炎性反應。

circ_0004951、circACTR2在DKD患者的腎組織和HG處理后的腎小管上皮細胞中均顯著上調。circ_0004951通過miR-93-5p/NLRP3通路，促進腎小管上皮細胞焦亡[52]。減少circACTR2 表達可降低細胞焦亡、IL-1β的釋放以及ColⅣ和FN的產生，進而調節DKD的細胞焦亡、炎癥及纖維化[53]。circ_0000181則通過調節 miR-667-5p/NLRC4軸，促進IL-1β和IL-18釋放，也可引起細胞焦亡[54]。

因此，通過影響作用于細胞程序性死亡的circRNA，可以為延緩DKD進展提供新的方向。

4 小結

綜上，circRNA可通過氧化應激、ECM沉積、炎癥、EMT、細胞凋亡、焦亡等方式參與腎小球硬化和腎小管間質纖維化，加重或延緩腎臟纖維化，與DKD進展密不可分，為DKD的診斷與治療提供了新靶點。同時circRNA具有高度保守性與穩定性，以及細胞和組織特異性，circRNA有望成為DKD診斷及治療的生物標記物。雖然通過circRNA診斷與治療DKD的前景廣闊，但上述研究僅限于動物實驗，案例數量相對較少，作用機制不夠透徹，尚未形成明確的信號通路，仍需深入探索，尋求更完整的機制理論，提供更安全的診斷與治療手段。所以circRNA在DKD中的作用還有待于進一步的研究。