LncRNA SNHG12在惡性腦膠質瘤中的表達水平及臨床意義

邵穎穎，李 雙，何淑芬，李燦濤，丁少波，何瑞榮

(1.南方醫科大學附屬東莞醫院 藥學部，廣東 東莞523059；2.中南大學湘雅醫院 臨床藥理研究所，湖南 長沙410008)

惡性腦膠質瘤是一種致死程度較高的惡性腦腫瘤，占成人原發性腦部腫瘤的80%[1]?，F有的治療手段主要以手術聯合放化療為主，雖然近年來此疾病的治療手段有了明顯提升，但是患者的預后仍不理想，中位生存時間只有14個月，五年內的存活率小于5%[2-3]。因此，尋找到預后生物標志物可以為此疾病的預后治療提供新的思路。長鏈非編碼RNA(Lnc RNA)是一種長度大于200nt的RNA分子，在細胞生長分化、細胞周期調控、細胞凋亡、遷移侵襲、免疫反應等多種生命活動中均發揮重要作用[4]。其中，小核仁RNA宿主基因12(SNHG12)在多種癌癥中均有異常表達[5-10]，且在腦膠質瘤中已有報道顯示其與此疾病病理分級、不良預后有關[11]，本研究結合公共生物信息數據庫中以及國內醫院收集到的病例樣本信息，通過探討LncRNA SNHG12在腦膠質瘤中的表達水平，分析其是否可作為腦膠質瘤預后良好指標。

1 資料與方法

1.1 數據庫樣本數據收集根據研究目的與研究內容確定研究樣本的篩選標準為樣本數較大，至少大于50例且有正常對照組的數據集，據此標準從GEO數據庫下載GSE4290數據集，對其中23例正常腦組織樣本(癲癇患者腦組織)和153例惡性腦膠質瘤樣本中LncRNA SNHG12表達進行相關數據分析，同時，對從TCGA數據庫中下載的614例惡性腦膠質瘤患者的LncRNA SNHG12表達進行分析。并且，從GEO數據庫下載GSE4271數據集以及TCGA數據庫中下載惡性腦膠質瘤患者的臨床病理資料進行整理，分析LncRNA SNHG12表達對惡性腦膠質瘤患者預后的影響。

1.2 臨床資料選取2007 年至 2013 年在湖南省中南大學附屬湘雅醫院的91例Ⅰ-Ⅳ級惡性腦膠質瘤患者和12例腦外傷患者或癲癇患者。本研究樣本采集獲得中南大學湖南省重點實驗室臨床藥理研究所獨立倫理委員會的倫理批件(CTXY-1300041-3)，患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.3 納入與排除標準

1.3.1納入標準 (1)2007年至2013年在湖南省中南大學附屬湘雅醫院新診治為多形性膠質母細胞瘤，并經該院神經疾病病理科根據2007年版的膠質瘤分級指南確診；(2)行根治性手術，術前未行任何放射性治療、化學藥物治療以及手術治療；(3)隨訪資料以及病例信息均完整；(4)患者知情并自愿同意參加本研究，簽署知情同意書。

1.3.2排除標準 (1)復發性膠質瘤患者；(2)初次手術后行放射性治療、化學藥物治療以及手術治療的膠質瘤患者；(3)死于除了腫瘤進展病因之外原因的膠質瘤患者；(4)病例信息或隨訪資料不完整。

1.4 隨訪采用門診或者電話的方式進行隨訪，隨訪時間為患者確診后的1-60個月，如果患者死亡隨訪時間結束。

1.5 主要試劑與儀器Trizol(美國Invitrogen公司，批號：15596018)；氯仿(批號：67-66-3)，異丙醇(批號：67-63-0)，乙醇(批號：64-17-5)均購自國藥集團化學試劑有限公司；RNA反轉錄試劑盒 PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa，批號：RR037A)；SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(美國Invitrogen公司，批號：C11744-100)；引物由上海博尚生物科技有限公司合成。核酸濃度測定儀Nanodrop 2000(美國Thermoscientific公司)；普通PCR擴增儀AG6321(德國Eppendorf公司)；實時熒光定量 PCR 儀(Roche LC480公司，瑞士)；低溫高速離心機(Eppendorf公司，德國)。

1.6 方法

1.6.1RNA的提取 取腦膠質瘤組織和正常腦組織解凍后，超聲勻漿，加入1 ml Trizol試劑，充分混勻后室溫靜置10 min；加入200 μl氯仿上下顛倒10次并在振蕩器上振蕩15 s，靜置5 min待充分乳化或呈乳白色后在4℃，12 000 g離心15 min；小心吸取收集上層無色水相層于新的1.5 ml EP管中并加入500 μl異丙醇，上下顛倒10次充分混勻室溫靜置10 min后4℃，12 000 g離心15 min；輕輕倒去上清加入1 ml無水乙醇慢慢加至EP管中(注意勿觸及沉淀)，輕輕上下顛倒10次后4℃，12 000 g離心5 min，重復操作一次后棄去上清，置于室溫干燥15 min后加入合適量(約20 μl)DEPC水溶解RNA，待溶解完全后保存在-80℃超低溫冰箱中備用。

表1 引物序列

1.7 統計學方法采用SPSS 18.0軟件(IBM,SPSS,Chicago,IL)進行一般統計分析。所有數據以均數±標準差表示。采用Student’st檢驗比較腦膠質瘤組織與正常腦組織樣本間LncRNA SNHG12的表達水平。LncRNA SNHG12表達水平與臨床病理特征的關系采用皮爾遜卡方檢驗或費舍爾精確檢驗。采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗法來比較計算總生存率。臨床病理特征變量和LncRNA SNHG12表達水平對總生存率的影響通過單變量和多變量分析進行評估。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA SNHG12在腦膠質瘤組織以及正常腦組織中的表達水平比較對從GSE4290和TCGA數據庫中下載的樣本的表達數據進行分析，結果顯示LncRNA SNHG12在腦膠質瘤中的表達水平明顯高于正常腦組織，且隨著腦膠質瘤惡性程度的升高而升高，見圖1。采用qRT-PCR法對從湖南省湘雅醫院收集到的91例Ⅰ-Ⅳ 級惡性腦膠質瘤組織和12例正常腦組織中LncRNA SNHG12的表達水平進行檢測，結果發現，與正常腦組織相比，腦膠質瘤組織中LncRNA SNHG12呈現高表達水平，且與數據庫中的樣本分析結果一致，也隨著膠質瘤病理等級的升高而升高，見圖2。

圖1 LncRNA SNHG12在GSE4290和TCGA數據庫中的表達差異

圖2 LncRNA SNHG12在膠質瘤中高表達與膠質瘤病理分級相關

2.2 LncRNA SNHG12表達與腦膠質瘤患者臨床病理特征的關系在對湘雅醫院收集的惡性腦膠質瘤患者的臨床病例資料進行進一步分析，以腦膠質瘤患者LncRNA SNHG12表達水平均值為分界線，高于平均值為高表達，低于平均值為低表達。腦膠質瘤組織中LncRNA SNHG12表達情況與患者年齡、性別、病灶位置無關(P值分別是0.437,0.580,0.203)，與患者病理分級有關(P<0.001)，見表2。

2.3 影響腦膠質瘤患者預后因素的Cox回歸分析為評估LncRNA SNHG12表達對膠質瘤患者的預后價值，進一步對湘雅醫院收集的惡性腦膠質瘤患者的臨床病例資料進行Cox模型多因素分析結果顯示LncRNA SNHG12過表達(HR=0.161,95% CI=0.083-0.312,P<0.001)，腫瘤分級(HR=0.381,95% CI:0.220-0.659,P=0.001)和病灶位置(枕骨vs.顳部)(HR=0.211,95% CI=0.048-0.928,P=0.039) 是影響腦膠質瘤預后的危險因素。Cox比例風險模型多因素分析結果顯示，LncRNA SNHG12的表達水平(HR=0.173,95% CI=0.084-0.358,P<0.001)和腫瘤分級(HR=0.458,95% CI=0.242-0.868,P=0.017) 是影響腦膠質瘤患者生存的獨立預后指標 ，見表2。

表2 LncRNA SNHG12與腦膠質瘤患者臨床病理特征的關系

2.4 LncRNA SNHG12表達水平與腦膠質瘤患者預后的關系根據LncRNA SNHG12表達的中位數，分為高表達組和低表達組。結果顯示，在TCGA(圖3A)和GSE4271(圖3B)數據集中，LncRNA SNHG12的高表達均與膠質瘤患者的預后生存不佳相關。為了進一步評估驗證這一結果，對湘雅醫院收集的91例病人樣本進行同樣的分析，結果顯示與前述數據庫中分析結果一致，腦膠質瘤患者中LncRNA SNHG12高表達者的總存活率顯著低于低表達患者的總存活率(HR=1.984,95% CI=0.809-4.865,P<0.0001)(圖3C)。

圖3 LncRNA SNHG12在膠質瘤中的表達水平與患者預后的關系

3 討論

近年來，發現和識別用于診斷、治療和預后的潛在生物標志物已成為改善癌癥患者生存狀態不佳的重要途徑。越來越多的證據表明，LncRNA參與了多種生物學過程包括細胞的生長、周期調控、凋亡以及癌癥在內的多種疾病的發生發展過程[12]。隨著基因芯片技術的發展，越來越多的LncRNA被鑒定為癌癥患者的潛在生物標志物和治療靶點。腦膠質瘤作為一種5年生存率極低的惡性腫瘤，迫切需要新的預后標志物和治療靶點[13]。

研究表明，LncRNA在腦膠質瘤的發生發展中發揮重要作用[14-16]。Ruan W.等闡明了LncRNA SNHG12通過誘導AMOT基因過表達促進骨肉瘤細胞的增殖和遷移[17]。Lan等發現LncSNHG12在肝癌細胞中可以通過競爭性結合miR-199 a/b-5p而間接影響NF-κB通路來調控肝癌細胞的凋亡和遷移[18]。在結直腸癌中，上調的LncRNA SNHG12可以通過抑制癌細胞凋亡從而促進結直腸癌的發生與發展[19]。近年來，在腦膠質瘤的研究中雖已有報道顯示LncRNA SNHG12與此疾病病理分級、不良預后有關[20]，本研究通過對GEO數據庫、TCGA數據庫中以及從湘雅醫院收集到的患者病例資料信息以及qRT-PCR檢測LncRNA SNHG12表達水平進行分析，在不同人種不同國家地區來源的惡性腦膠質瘤患者中LncRNA SNHG12的表達水平顯著高于正常腦組織，且在高級別病理分級的惡性腦膠質瘤組織中的表達水平顯著高于低級別(P<0.05)；且LncRNA SNHG12高表達的惡性腦膠質瘤患者的總存活率顯著低于低表達患者(HR=1.984,95% CI=0.809-4.865,P<0.0001)。在對湘雅醫院收集的惡性腦膠質瘤患者的臨床病例資料進行進一步分析發現，在惡性腦膠質瘤組織中LncRNA SNHG12的表達情況與患者年齡、性別以及病灶位置無關(P值分別是0.437,0.580,0.203)，與患者的腫瘤病理分級有關(Ⅰ-Ⅱ級 vs.Ⅲ-Ⅳ級,P<0.0001)；Cox模型多因素分析結果顯示，患者的腫瘤病理分級是影響惡性腦膠質瘤患者預后的獨立危險因素(HR=0.173,95% CI=0.084-0.358,P<0.001)。因此，結合公共數據庫樣本以及醫院收集的臨床樣本信息，對國內外患者進行統一分析后認為LncRNA SNHG12可能成為膠質瘤患者潛在預后療效的生物標志物且不受人種地域等條件的限制，具有普適性。