長鏈非編碼RNA MALAT1在結腸癌中的表達及其對SW620細胞增殖、遷移的影響

吳 懼，殷海鵬，程 楠，尹 敏，尹家俊，李 賀

(1.大連大學附屬中山醫院 肝膽外科，遼寧 大連116001；2.腫瘤生物醫療和基因檢測重點實驗室，遼寧 大連116001；3.大連醫科大學，遼寧 大連116044)

根據2021年結直腸癌癥篩查指南結果顯示，結腸癌是世界范圍內最為常見的惡性腫瘤之一，發病率位居惡性腫瘤第三位[1-2]。結腸癌的發病過程緩慢隱匿并且早期無典型表現，相關統計顯示早期有15%-25%發生遠處轉移，患者預后差，五年生存率低[3-5]。手術治療是目前根治結腸癌的主要手段。肺癌轉移相關轉錄本1(MALAT1)是通過對非小細胞肺癌惡性行為的研究首次被發現，隨后又發現LncRNA MALAT1不僅僅在肺癌中起作用，還參與很多其他惡性腫瘤的發生進展過程，影響著腫瘤的惡性行為[6-8]。PI3K/Akt通路參與多種惡性腫瘤的發生，在骨肉瘤、卵巢癌等惡性腫瘤的相關研究中均存在該通路的參與[9-10]，并且與LncRNA MALAT1的表達相關。在結腸癌中二者是否同樣存在某些相關性，目前尚無明確報道。本研究旨在探討LncRNA MALAT1在結腸癌中的表達情況，觀察其對SW620細胞增殖、遷移的影響，并初步探究LncRNA MALAT1下游的潛在轉導分子，闡明其在結腸癌發生發展中的作用。

1 材料與試劑

1.1 一般資料收集大連大學附屬中山醫院行結腸癌根治術患者的術后標本40例，所有手術均為同一團隊完成，臨床資料完整。細胞系為SW620，其高表達LncRNA MALAT1[11]。引物由大連寶生物科技有限公司設計及合成，RT-PCR儀購自美國ABI公司，蛋白電泳及轉膜設備購自美國Bio-Rad公司，抗體購自華安生物技術有限公司，DAB試劑盒SP9001購自北京中杉金橋生物技術有限公司，DMEM培養基購自美國HyClone公司，siRNA干擾序列購自上海吉瑪公司。

1.2 方法

1.2.2Western blot實驗 提取總蛋白，考馬斯亮藍染色法對樣品蛋白定量檢測。SDS-PAGE電泳分離，濕法轉膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉 1 h，一抗(P13K 1∶2000，Akt l∶2000，Beta-actin 1∶500)，4℃孵育過夜加二抗(1∶20 000)，室溫孵育1 h，用ECL法化學發光，用Image J分析掃描灰度值，β-actin設置為內參照。

1.2.3免疫組化實驗 切片55℃烤片過夜或者60℃烤片2-4 h。脫蠟后梯度濃度酒精脫水，采用高壓熱修復法進行抗原修復，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，山羊血清工作液對組織進行封閉，滴加一抗，置于4℃冰箱過夜。滴加生物素標記山羊抗兔IgG聚合物，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，孵育20 min，DAB工作液顯色。復染、樹膠封片，陽性和陰性結果依據H-score評分方法進行判讀。

1.2.4si-RNA細胞轉染 干擾序列為si-MALAT1P:5′-GGGCUGACAUUAACUACAATT-3′；si-NC：5′-UGACCUCAACUACAUGGUUTT-3′。將細胞種入6孔板中，細胞密度要求大于70% 進行轉染；5 μl DMEM 稀釋于100 μl的無血清DMEM中，混勻，靜置5 min；將20 μl si-MALAT1及si-NC分別稀釋于100 μl的無血清DMEM 后，混勻，靜置 5 min； A、B液室溫下孵育 20 min；加入2 ml 完全培養基，再加入混合溶液，置于培養箱中。

1.2.5CCK-8增殖實驗 在96孔的培養板內種下待檢測細胞；分別于0 h、24 h、48 h、72 h時加入 CCK-8試劑(10 μl /孔)，避光操作，孵育 2 h；用酶標儀對樣品吸光度進行檢測。

1.2.6Transwell實驗 在含有20%胎牛血清培養基的下室中放入Transwell小室(孔徑8 μm)，將細胞接種在含無血清培養基的上室中，培養24 h。PBS清洗，多聚甲醛固定，最后結晶紫進行染色。顯微鏡下觀察拍攝。

1.2.7集落形成實驗 在6孔板中接種轉染后的細胞，每孔約1000個；定期更換培養基，兩周后固定(無水甲醇)，染色(結晶紫)，計數菌落形成數量。

1.3 統計學分析

SPSS19.0統計軟件進行實驗數據分析，計量資料采用均數±標準差表示，計數資料采用n(%)表示，兩組間計量資料采用t檢驗，計數資料采用卡方檢驗，P<0.05表示差異存在統計學意義。

2 結果

2.1 組織中LncRNA MALAT1的表達情況及與患者臨床特征的關系

RT-PCR技術對40例結腸癌組織及癌旁組織檢測發現：癌組織中LncRNA MALAT1的表達較癌旁組織中更為明顯，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖1)。癌組織中高于平均值水平作為高表達結果，與患者臨床特征進行比較，發現LncRNA MALAT1的表達與患者的淋巴結轉移存在相關性(P<0.05)(表1)。

圖1 RT-PCR法測定組織中LncRNA MALAT1的表達，P<0.05

表1 患者臨床特征與LncRNA MALAT1高表達及低表達的比較

2.2 p-PI3K、p-Akt在結腸癌組織中的表達

通過免疫組化實驗觀察癌及癌旁組織中蛋白p-PI3K、p-Akt表達情況(圖2)，癌組織中p-PI3K的陽性染色結果28例(70%)，癌旁組織9例(22.5%)；癌組織中p-Akt的陽性染色結果27例(67.5%)，癌旁組織7例(17.5%)；通過卡方檢驗進行分析，發現二者在癌及癌旁組織中存在統計學差異(χ2=18.15，P<0.05，χ2=20.46，P<0.05)。

圖2 免疫組化法檢測組織中p-PI3k、p-Akt的表達(×200)

Wesern blot定量分析蛋白p-PI3K及p-Akt表達水平，實驗結果同樣顯示，在癌組織中，p-PI3K及p-Akt蛋白表達水平升高(P<0.05)(圖3)。

圖3 Western blot檢測組織中p-Akt、p-PI3k的表達(P<0.05)

2.3 結腸癌患者LncRNA MALAT1的表達與p-PI3K及p-Akt的關系

將p-PI3K、p-Akt表達結果與LncRNA MALAT1的表達情況進行卡方檢驗分析，其中LncRNA MALAT1表達水平高于平均值作為高表達的例數，結果顯示二者之間有明顯相關性(P<0.05)(表2)。

表2 LncRNA MALAT1與p-PI3K、p-Akt的關系

2.4 下調細胞中LncRNA MALAT1對p-PI3K、p-Akt表達的影響

通過轉染siRNA至癌細胞中，轉染后癌細胞中LncRNA MALAT1的表達水平明顯下降(圖4a)，對si-MALAT1及si-NC組細胞中的p-PI3K、p-Akt的表達水平進行檢測，結果發現，下調LncRNA MALAT1的表達，蛋白p-PI3K、p-Akt的水平也下降(P<0.05)(圖4b、4c、4d)。

圖4 細胞轉染及Western blot檢測轉染后細胞中p-PI3K、p-Akt的表達(P<0.05)

2.5 下調LncRNA MALAT1的表達對結腸癌細胞增殖、遷移的影響

CCK-8實驗檢測si-MALAT1與si-NC組細胞增殖情況如圖5a，72 h時，si-MALAT1(1.451±0.112)細胞的OD值較si-NC(2.019±0.131)組降低(t=8.405，P<0.05)。Transwell實驗結果發現，si-MALAT1組細胞遷移數較si-NC組細胞遷移數減少(圖5b、5c、5d)(P<0.05)。

圖5 細胞增殖曲線及細胞遷移實驗檢測細胞增殖、遷移能力(×200)(P<0.05)

2.6 下調LncRNA MALAT1對細胞集落形成能力的影響

結果顯示：si-MALAT1組14.9%較si-NC組27.2%細胞集落形成率下降(P<0.05)(圖6a、6b、6c)。

圖6 細胞集落實驗檢測集落形成能力(P<0.05)

3 討論

結腸癌在全球惡性腫瘤中的發病率持續上升，其轉移率高，雖然對腫瘤基因的研究越來越深入，但機制復雜，尚不明確[12]，治療方式以手術切除為主，然而術后轉移復發仍十分常見，有研究表明新輔助放化療和腸系膜切除聯合治療可使局部復發率降低到10%以下，但并沒有顯著延長患者的生存期[13-15]。近年來，非編碼基因在腫瘤相關研究中進展迅速，許多研究發現LncRNA與腫瘤的關系十分密切，可以通過影響基因轉錄、蛋白表達等過程參與腫瘤的進展[16]。LncRNA MALAT1作為一種新的LncRNA在2003年肺癌的相關研究中被發現[17]，隨后在其他惡性腫瘤的研究中發現其參與并影響腫瘤的進程，在膀胱、乳腺等惡性腫瘤中均有報道，LncRNA MALAT1促進了惡性腫瘤的進展過程，尤其與腫瘤轉移及復發密切相關[18]。

本研究的結果顯示，在結腸癌中，癌旁組織LncRNA MALAT1的表達量較癌組織中的表達降低；轉染si-RNA后，腫瘤細胞中LncRNA MALAT1的表達下降，細胞的增殖、遷移、集落形成等能力明顯減弱。該結果與LncRNA MALAT1最初在肺癌的相關研究中結果一致[19]，而導致該結果的發生可能與LncRNA與其他基因相互作用有關。研究表明LncRNA MALAT1可以作用多種微小RNA來促進其惡性行為，有學者發現，在肝癌中LncRNA MALAT1可以通過抑制miR-140基因，使血管生成因子A增加；另有研究顯示LncRNA MALAT1與miR-202存在相互結合位點，LncRNA MALAT1表達抑制了miR-202導致骨肉瘤肺轉移能力增強；LncRNA MALAT1還能與miR-485-3p相互作用，解除對c-MET和Akt3/mTOR信號的抑制，下調LncRNA MALAT1或過表達miR-485-3p可抑制腫瘤生長和體內肺轉移[20-21]，以上均表明LncRNA MALAT1表達增高可以作用于其他的基因來行使功能。此外在胰管腺癌研究中發現LncRNA MALAT1敲除后，抑制miR-217的表達，而KRAS蛋白是其明確的作用靶點，最終影響KRAS蛋白的表達，影響了腫瘤轉移侵襲過程[22]。本研究得到LncRNA MALAT1對結腸癌的惡性行為起到了促進作用結果，可能與LncRNA MALAT1表達增高，影響某些微小RNA的表達，導致腫瘤相關編碼基因表達發生變化，促進腫瘤的發生。

本研究對PI3K/Akt通路中活化的關鍵蛋白進行檢測發現，癌組織中LncRNA MALAT1表達高，p-PI3K和p-Akt的含量升高，下調細胞中LncRNA MALAT1表達，p-PI3K、p-Akt蛋白的表達量隨之下降。腫瘤中的PI3K/Akt通路是一條證實參與腫瘤發生的傳導通路，參與細胞周期的各個階段，在細胞增殖和凋亡過程中起著不可替代的作用。研究發現PI3K、Akt總量相對恒定，其發揮作用取決于關鍵蛋白的活化情況，PI3K可被相應受體激活，如RAS蛋白、酪氨酸激酶受體等，活化后的PI3K可使下游分子Akt活化為p-Akt，進而作用于下游分子，影響細胞周期，促進細胞有絲分裂過程[23-25]。在腫瘤細胞中，該通路異?；罨?，可導致細胞出現異常增殖、細胞凋亡，促進新生血管形成，進而引發腫瘤細胞分化及遠處轉移等惡性行為[26]。LncRNA MALAT1可以通過PI3K/Akt途徑調節細胞凋亡，影響腫瘤對化療藥物的耐藥性[27]；在骨肉瘤中PI3K/Akt信號通路可以被LncRNA MALAT1激活，從而使腫瘤發生了遠處轉移[28]。而結腸癌中LncRNA MALAT1與PI3K/Akt通路的關系尚未明確。根據既往研究及本實驗結果，認為在結腸癌中，LncRNA MALAT1與PI3K/Akt通路存在一種正向的相關性，影響了腫瘤的進展。

綜合以上結果，LncRNA MALAT1在結腸癌中的表達上調，促進了腫瘤的增殖、遷移；并且與PI3K/Akt通路存在著一種正相關性。