滑膜組織在臍帶間充質干細胞治療骨關節炎中的作用及機制

曹娟 姚瑤 李玲玲 武文卉 肖云云 丁從珠

骨關節炎(osteosbrthritis，OA)是老年人的常見病之一，是一種累及關節軟骨、滑膜、軟骨下骨、韌帶、半月板及關節周圍肌肉的全關節組織的復雜病癥，呈進行性加重，全身所有活動關節均可受累。隨著我國人口老齡化，OA的發病率越來越高。流行病學調查數據表明，我國40歲以上人群OA患病率為10%～17%，60歲以上OA患病率達到50%，75歲以上OA患病率則達80%之高[1]。目前OA的發病機制仍然不明確，尚無有效的根治方法。既往研究主要針對OA關節軟骨退行性改變機制進行研究，而關于滑膜組織在OA發生、發展中的作用研究尚在起步階段[2]。

臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)來源于中胚層，具有自我增殖和多向分化能力，在不同的誘導條件下可分化成不同的組織細胞，在全身多種組織如骨髓、臍帶等組織中均可分離，因而成為再生醫學的研究熱點。近年來部分研究發現，自體MSCs發揮對組織的修復作用不僅僅是簡單的分化取代損傷組織，還能同時分泌多種活性因子，改變損傷組織周圍的微環境，發揮高效的免疫抑制和抗炎作用，從而修復組織損傷[3-4]。本研究擬探討滑膜在OA發病中的作用及MSCs對OA滑膜的保護作用，為MSCs廣泛用于臨床治療OA提供更多的理論依據。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 L-DMEM細胞培養液、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素(GIBCO 公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；倒置顯微鏡(日本olympus公司)；木瓜蛋白酶(美國 SIGMA公司)；IL-6、基質金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP-13)、細胞外信號調節激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)抗體(武漢三鷹生物技術有限公司和英國 abcam 公司)；病理組織切片機(上海徠卡儀器有限公司)。

1.2 實驗對象及分組 選取健康5～6月齡新西蘭大白兔(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院實驗動物中心提供)15只，體質量2.5～3.0 kg，隨機平均分為對照組、OA模型組、UC-MSCs干預組3組，每組5只。

1.3 UC-MSCs制備 將人臍帶取下后立即無菌條件下浸入L-DMEM培養液4 ℃保存，至超凈臺內清洗臍帶組織，將臍帶組織按步驟消化清洗最后接種于培養瓶中，定期換液、接種傳代培養。干預前3 h收集第3～4代的UC-MSCs并鑒定，具體操作方法同本人前期發表論文[5]。

1.4 模型建立及給藥方法 4%木瓜蛋白酶注射液0.5 mL分別于第1、4、7天沿右側關節間隙注射至OA模型組和UC-MSCs干預組兔后膝關節腔內，共注射3次，建立動物模型。于2周后給予對照組、OA模型組膝關節腔內注射生理鹽水，UC-MSCs干預組膝關節腔內注射1×106/L 0.5 mL UC-MSCs細胞懸液[6]。干預4周后觀察兔膝關節磁共振影像學形態，觀察后處死實驗動物，分別取滑膜組織置入預先配制好的固定液(4%甲醛)中固定，待行組織學檢測(HE染色和免疫組織化學染色檢測)，部分滑膜組織-80 ℃冷凍保存，待送檢Western blot檢測。

1.5 磁共振檢查方法 本實驗采用飛利浦3.0 T磁共振成像系統(Ingenia，Philips，荷蘭)，實驗兔予陸眠寧肌注麻醉后仰臥位固定于磁共振平臺上，采用8通道頭部正交磁共振線圈進行冠狀位和矢狀位掃描，獲取PDW-SPAIR序列圖像，采集參數如下：TR 3000 ms，TE 30 ms，翻轉角90°，視野10 cm，層厚1.5 mm，采集時間150 s。

1.6 HE染色 取關節滑膜組織標本經4%甲醛固定，常規石蠟包埋，4μm切片，行HE染色，并于光學顯微鏡下行組織學觀察。

1.7 免疫組化染色法 免疫組化標本按照組織學方法制片，石蠟切片常規脫蠟，免疫組化采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化法(SP)，按照試劑盒步驟進行，每張切片取5個高倍視野，用Image Pro Plus 5.0.2圖像分析軟件測定各組光密度值。

1.8 Western blot方法 選取實驗兔膝關節滑膜組織20～40 mg制備樣品，按蛋白免疫印跡法測定樣品中的蛋白濃度，依次進行電泳、轉膜、封閉抗原抗體、一抗、二抗孵育以及ECL顯色曝光后得到目的蛋白IL-6、MMP-13、MAPK、ERK及內參β-actin條帶，采用Gel-Pro 32軟件分析條帶灰度值，計算蛋白的相對表達量。

1.9 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件分析。所有數據均采用均數±標準差(±s)表示，常規進行正態性檢驗、方差齊性檢驗。計量資料組間比較采用t檢驗或t′檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 干預后關節滑膜及軟骨磁共振影像 磁共振檢查顯示，對照組兔后膝關節形態信號正常，股骨髁關節軟骨表面光整，滑膜信號正常，關節腔內見少許關節液；OA模型組股骨髁關節軟骨表面毛糙，層次不清，滑膜增厚，關節腔積液較對照組明顯增多；UC-MSCs干預組軟骨信號欠均勻，滑膜增厚較OA模型組減輕，關節腔積液較OA模型組明顯減少。見圖1。

圖1 不同組別兔膝關節磁共振影像

2.2 關節滑膜HE染色結果 結果顯示，對照組滑膜無明顯炎性細胞浸潤，無明顯增厚；OA模型組滑膜可見大量炎性細胞浸潤，滑膜增生、水腫；UC-MSCs干預組與OA模型組相比，炎性細胞浸潤明顯減少，滑膜增生、水腫減輕。見圖2。

圖2 不同組別兔膝關節滑膜組織HE染色圖(×100)

2.3 各組關節滑膜組織IL-6、MMP-13、ERK蛋白表達比較 免疫組化結果顯示，OA模型組IL-6、MMP-13、ERK表達較對照組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；UC-MSCs的干預組MMP-13、ERK表達較OA模型組明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，IL-6表達水平與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組滑膜組織IL-6、MMP-13、ERK免疫組化光密度值(±s,n=5)

表1 各組滑膜組織IL-6、MMP-13、ERK免疫組化光密度值(±s,n=5)

項目對照組OA模型組UC-MSCs干預組IL-611.97±0.9919.74±1.39*18.51±1.05MMP-1315.60±1.8123.67±1.34*18.61±0.61#ERK17.76±2.6239.38±2.22**19.88±1.49##注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01,與OA模型組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.4 各組關節滑膜組織IL-6、MMP-13、MAPK、ERK蛋白表達Western blot檢測結果比較 OA模型組IL-6、MMP-13、MAPK、ERK表達量均較對照組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；UC-MSCs干預組IL-6、MMP-13、MAPK、ERK表達量較OA模型組明顯下降(P<0.01)，較對照組表達稍高，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 Western blot檢測各組滑膜組織IL-6、MMP-13、MAPK、ERK蛋白表達相對灰度值(±s,n=5)

表2 Western blot檢測各組滑膜組織IL-6、MMP-13、MAPK、ERK蛋白表達相對灰度值(±s,n=5)

項目對照組OA模型組UC-MSCs干預組IL-60.097±0.1200.557±0.027**0.191±0.012##MMP-130.040±0.0010.337±0.018**0.070±0.012##ERK0.293±0.0151.248±0.067**0.444±0.067##MAPK0.096±0.0120.371±0.036**0.138±0.015##注:與對照組比較, **P<0.01,與OA模型組比較, ##P<0.01

3 討論

OA是一種老年常見疾病，嚴重危害病人健康，并給家庭和社會帶來沉重負擔。因此，早期預防及診治OA，改善國人晚年生活質量將成為亟待解決的重點課題。然而迄今為止，OA的確切病因和發病機制尚不清楚，對于OA的治療方法主要有疼痛對癥處理和晚期關節置換手術，暫無有效阻止疾病進展的治療方法，所以臨床上有待挖掘新的治療手段。本研究小組先前研究發現OA的發生發展與機體炎癥及軟骨損傷有關[5]，且OA模型組的滑膜組織有明顯炎癥改變，故認為滑膜病變參與OA的發生發展。

滑膜位于關節囊的內層，是一種具有特殊功能的半透膜，能合理控制各種分子進出關節腔，從而維持關節腔滑膜液的有效成分，是維持關節生理和功能的重要結構。滑膜不僅能分泌滑膜液以減少關節面的摩擦力，防止關節粘連，還能為關節軟骨提供有效的營養成分并排泄軟骨組織的代謝產物等。滑膜炎癥是導致OA病理學進展的重要因素，滑膜炎癥與軟骨損傷相互影響，如OA軟骨損傷降解，軟骨碎片與滑膜直接接觸[7-8]，滑膜細胞受到損傷刺激，在免疫系統的作用下，分泌炎癥介質，引發局部炎性反應，加速軟骨損傷及退化變性[9]。因此，可以認為OA不僅僅是軟骨退變，滑膜炎癥在OA發病中亦扮演重要角色。Guermazi等[10]對404例不同程度的OA病人研究發現，74%OA病人有滑膜炎癥改變。Felson等[11]的研究顯示，滑膜炎是OA進展的獨立危險因素。滑膜病變后會產生多種介質，如細胞因子、溶酶體、膠原酶、中性蛋白酶等，這些介質對軟骨細胞都存在不同程度的損傷，無論關節病變嚴重程度如何，都能增強滑膜細胞的凋亡，從而影響關節軟骨的損傷程度[12-13]。因此，推測滑膜病變尤其是慢性炎癥是軟骨細胞損傷及退變的機制之一。

本研究發現，造模成功的OA模型組兔膝關節的磁共振影像顯示滑膜增厚，關節腔有積液，提示滑膜發生病理性改變。病理學觀察OA模型組兔后膝關節可見滑膜大量炎性細胞浸潤，滑膜增生、水腫，這些均證實滑膜改變參與OA的發病。李保馳等[14]研究發現，OA病人滑膜組織的MMP-3、MMP-13表達水平較正常關節滑膜中增加，且隨著關節炎病情加重，MMP-3、MMP-13表達水平呈進行性升高，二者呈正相關性，可以推測滑膜組織病變參與OA發生發展，并認為滑膜分泌MMP-3、MMP-13等炎癥因子刺激軟骨細胞損傷，從而導致OA的進展。Piecha等[15]通過MMP-13選擇性抑制劑研究MMP-13對OA的作用，結果顯示80%人類OA軟骨的降解可被MMP-13選擇性抑制劑抑制，可見MMP-13在OA進展中發揮關鍵的作用。李躍軍等[13]研究發現，OA病變過程中MMP-13和β-catenin均呈高表達，并推斷β-catenin參與OA軟骨退變和滑膜炎癥反應等病理變化過程可能是通過干預Wnt信號通路，從而影響MMP-13表達來實現的。本研究結果顯示，OA模型組滑膜組織IL-6、MMP-13表達水平較對照組明顯升高，與先前的研究結果一致[13-15]。

本研究發現，OA模型組滑膜組織中ERK表達量較對照組升高，故推斷滑膜組織中ERK信號通路的活化參與OA的形成。ERK信號通路激活后發生磷酸化改變，參與細胞的增殖和分化，但是，ERK過度活化可抑制細胞增殖并促進凋亡，加重組織的衰老退變。師婕等[16]的研究表明，ERK抑制劑能降低MMP-3水平，減少關節軟骨退變，抑制軟骨細胞凋亡，從而減緩OA的發展。Zhou等[17]的研究顯示，OA病人MAPK/ERK信號通路過度活化，MMP-13表達增加，從而加重OA進展。本研究結果顯示，OA模型組滑膜組織MAPK、ERK表達量較對照組明顯升高，說明OA關節滑膜組織MAPK/ERK信號通路激活。同時本研究還發現，MAPK/ERK表達增高與IL-6、MMP-13表達增高呈正相關，這與Guo等[18]的研究結果一致，他們發現ERK抑制劑處理后的細胞中IL-6的表達明顯下降，ERK活化誘導IL-6的表達，IL-6通過誘導破骨細胞形成，導致骨吸收增加。楊豐建等[19]研究發現，OA家兔組MMP-1、MMP-13與ERK蛋白表達水平也較對照組升高，MMP-13的升高與ERK信號通路激活之間也存在一定的關聯性。故可認為OA滑膜組織的MAPK/ERK信號通路活化，刺激滑膜細胞分泌IL-6、MMP-13，從而刺激破骨細胞增生、軟骨細胞損傷，導致OA進展，具體機制仍需進一步實驗證實。

MSCs來源豐富，可從骨髓、脂肪、滑膜等多種組織中分離出來。MSCs還具有調節免疫和抗炎作用，能分泌多種細胞因子和介質，并通過細胞間相互作用調節損傷組織局部環境，活化其內源性祖細胞，從而發揮修復受損組織的作用。因此，在再生醫學領域，MSCs是治療OA的最理想選擇[20]。本研究結果顯示，UC-MSCs干預4周后OA關節滑膜組織IL-6、MMP-13、MAPK、ERK表達量較OA模型組下降，說明UC-MSCs可抑制滑膜促炎因子的分泌，抑制局部炎癥反應，從而保護軟骨細胞，抑制OA進展。

綜上，本實驗結果顯示，滑膜病變參與OA發病，滑膜組織的炎癥因子IL-6及MMP-13、MAPK、ERK蛋白高表達對軟骨細胞的凋亡及損傷有一定作用。本研究也進一步證實UC-MSCs能抑制滑膜炎癥因子的分泌，抑制MAPK/ERK通路活化，從而抑制OA進展。