FN1、LZTS2、ERBB3在甲狀腺癌演進過程中表達水平變化分析*

孟午生，程 娜，馬曉紅，郭 晶

北京市門頭溝區醫院內分泌科，北京 102300

甲狀腺癌是最常見的內分泌系統惡性腫瘤，根據國際癌癥研究機構團隊統計，2020年全球新發甲狀腺癌58.6萬例，我國新發22.1萬例，占全球新發甲狀腺癌的37.71%[1]。盡管甲狀腺癌病死率低，絕大多數患者經手術切除或術后接受131I治療可達到臨床治愈，但仍有部分患者會發生復發或轉移，影響其預后[2-3]。目前，甲狀腺癌發病機制尚未完全明確，探索相關分子機制仍然是研究的熱點。纖連蛋白1(FN1)是組織和體液中廣泛存在的一種高分子糖蛋白，參與細胞遷移、黏附、增殖和組織修復等過程，近年有研究報道顯示，FN1與宮頸癌、乳腺癌等惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移有關[4-5]。亮氨酸拉鏈腫瘤抑制因子2(LZTS2)是新近發現的一種腫瘤抑制基因，近年有研究報道顯示，LZTS2參與調控鼻咽癌、肝癌等惡性腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[6-7]。Erb-B2受體酪氨酸激酶3(ERBB3)是表皮生長因子受體家族成員，參與腫瘤信號轉導，與卵巢癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲有關[8-9]。目前，關于FN1、LZTS2、ERBB3在甲狀腺癌演進過程中的表達水平變化報道較少，本研究通過觀察FN1、LZTS2、ERBB3在甲狀腺癌組織中的表達水平變化情況，并分析其與臨床病理特征和預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2017年1月本院收治的110例甲狀腺癌患者作為研究對象，收集術中切除的部分癌組織和癌旁組織，液氮冷凍后采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA的表達水平。男43例，女67例；年齡35～78歲，平均(45.77±7.18)歲；病理類型：分化型88例，未分化型22例；腫瘤最大徑：≥1 cm 48例，<1 cm 62例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期64例，Ⅲ～Ⅳ期46例；淋巴結轉移：有轉移41例，無轉移69例。納入標準：(1)術后經病理檢查確診；(2)年齡≥18歲；(3)初診，未接受任何抗腫瘤治療；(4)接受根治性切除或姑息性切除；(5)可接受隨訪且資料完整。排除標準：(1)合并其他部位惡性腫瘤；(2)合并重要器官器質性病變；(3)全身感染性疾病。本研究所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書，并經本院倫理委員會批準。

1.2方法 將液氮冷凍組織研磨成末，采用TRIzol試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司，批號：15596-018)提取組織中總RNA,采用Takara試劑盒(北京寶日醫生物技術有限公司，批號：RR047A)轉錄合成cDNA，反轉錄反應體系共20 μL：RNA 1 μL、OligoDT 1 μL、5×RT Buffer 4 μL、dNTP 2 μL、M-MLV 1 μL、DEPC水11 μL；反應條件：42 ℃反轉錄反應60 min、70 ℃反轉錄酶失活反應10 min。Narodrop 2000分光光度計驗證cDNA濃度及純度，濃度及純度合格(A260/A280為1.8～2.0)通過美國伯樂CFX qRT-PCR儀和qRT-PCR試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，批號：JN0052)進行qRT-PCR擴增。引物由廣州銳博生物科技有限公司設計和合成。FN1上游引物：5′-TCAGTCGGTGGTCATCTTTGG-3′；下游引物：5′-CCTCCAGGTATCTTTTCCACTCT-3′。LZTS2上游引物：5′-TACCATCTGAGTTGCTGATTGC-3′；下游引物：5′-AGAGAGGAAGGAATGGGAGATC-3′；ERBB3上游引物：5′-TCCCAGAGTTCATACCAGGA-3′；下游引物：5′-AATCTGTGCATGAAGGGAAC-3′。內參GAPDH上游引物：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′；下游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。反應體系共25.0 μL：Green?Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、cDNA模板 2.0 μL、ddH2O 8.5 μL；反應條件：95 ℃預變性30 s、95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸15 s，循環40次，反應結束后得到各反應管Ct值，FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA相對表達水平采用2-ΔΔCt法計算。

1.3隨訪 患者出院后通過門診或電話方式隨訪5年，統計術后5年的總生存率。

2 結 果

2.1甲狀腺癌組織與癌旁組織中FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA表達水平比較 與癌旁組織比較，甲狀腺癌組織中FN1 mRNA、ERBB3 mRNA表達水平均升高，LZTS2 mRNA表達水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 甲狀腺癌組織與癌旁組織中FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA表達水平比較

2.2不同病理特征甲狀腺癌患者FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA表達水平比較 不同性別、年齡、病理類型、腫瘤最大徑甲狀腺癌患者FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；不同TNM分期、有無淋巴結轉移甲狀腺癌患者FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同病理特征甲狀腺癌患者FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA表達水平比較

2.3不同FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA表達水平甲狀腺癌患者總生存率比較 中位隨訪40個月，110例甲狀腺癌患者總生存率為81.82%(90/110)，根據甲狀腺癌組織中FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA表達水平分為高表達組和低表達組，Kaplan-Meier生存曲線結果顯示，FN1 mRNA、ERBB3 mRNA高表達組總生存率低于FN1 mRNA、ERBB3 mRNA低表達組，LZTS2 mRNA高表達組總生存率高于LZTS2 mRNA低表達組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表3。

注：A為FN1 mRNA高表達組和低表達組甲狀腺癌患者生存曲線；B為LZTS2 mRNA高表達組和低表達組甲狀腺癌患者生存曲線；C為ERBB3 mRNA高表達組和低表達組甲狀腺癌患者生存曲線。

表3 不同FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA表達水平甲狀腺癌患者總生存率比較[n(%)]

3 討 論

甲狀腺癌是起源于甲狀腺濾泡上皮或濾泡旁上皮細胞的惡性腫瘤，作為一種惰性腫瘤，其發病較慢，惡性程度較低，近年來隨著診療水平的提高和131I的應用，甲狀腺癌5年生存率已高達84.3%[10]。但是部分甲狀腺癌患者細胞形態和功能會在自然病程或治療過程中發生退行性改變，易出現腺外侵犯、血管侵襲、遠處轉移，預后較差[11]。甲狀腺癌的發生和發展是多階段和多因素共同參與的過程，目前各類靶向藥物相對缺乏，急需進一步了解甲狀腺癌的分子機制，以實現精準治療和判斷不良預后。

細胞外基質是為周圍細胞結構和蛋白及多糖纖維支持的膠狀結構，在腫瘤侵襲和轉移過程中，癌細胞先從原發部位脫落侵入細胞外基質，再與細胞間質和基底膜中分子黏附，協助癌細胞穿過細胞外基質和侵入其他部位[12]。FN1作為細胞外基質中主要的非膠原性糖蛋白，能幫助維持細胞骨架結構，以增強細胞間黏附。基于FN1與細胞外基質的關系，ZHAI等[13]研究報道，FN1能上調GATA結合蛋白6表達水平，促進口腔鱗狀細胞癌增殖、集落形成、侵襲和遷移。本研究結果顯示，甲狀腺癌組織中FN1 mRNA表達水平上調，且不同TNM分期和有無淋巴結轉移甲狀腺癌患者FN1 mRNA水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示FN1在甲狀腺癌中發揮促癌基因作用，其機制可能與FN1參與上皮-間質轉化(EMT)有關。EMT是一種正常的生理現象，是指上皮細胞在EMT過程中失去細胞間連接，使上皮細胞間結構松散，以促進配體發育和組織再生，若腫瘤細胞異常激活EMT，會賦予腫瘤細胞更強的運動性和侵襲性，促進腫瘤細胞侵襲和轉移[14]。有研究表明，FN1是一種新型的EMT標志物，FN1高表達能夠促進甲狀腺癌發生EMT，進而促進甲狀腺癌細胞黏附、遷移和侵襲[15]。本研究結果顯示，FN1 mRNA高表達組總生存率明顯降低，說明甲狀腺癌組織中FN1 mRNA高表達與患者預后密切相關，可成為甲狀腺癌預后的評估指標。

腫瘤的發生和發展與基因異常轉錄密切相關[16]。LZTS是一個在基因轉錄過程中發揮重要作用的家族，LZTS2是LZTS家族的第2個成員，能通過結合DNA的啟動子和增強子或通過蛋白間相互作用影響基因的轉錄過程。近年有研究發現，LZTS2在染色體的定位與抑癌基因“人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因”相鄰，并且在鼻咽癌、肝癌等多種惡性腫瘤中表達水平下調或缺失，在正常組織中表達水平升高[6-7]。然而，關于LZTS2與甲狀腺癌的關系報道較少。本研究結果顯示，甲狀腺癌組織中LZTS2 mRNA表達水平下調，并且與TNM分期、淋巴結轉移有關，提示LZTS2在甲狀腺癌中發揮抑癌基因作用，其機制可能與LZTS2參與調節Wnt/β-catenin有關。Wnt/β-catenin是目前公認的腫瘤相關信號通路之一，該通路異常活化與癌細胞多種惡性行為密切相關[17]。有研究表明，LZTS2的C-末端447-669氨基酸序列能與β-catenin的armadillo序列結合，抑制Wnt/β-catenin通路活化，同時LZTS2還能結合核因子-κB，抑制核因子-κB介導的β-catenin核內聚集過程，進而使Wnt/β-catenin通路激活[18-19]。本研究結果顯示，LZTS2 mRNA高表達組總生存率明顯升高，說明甲狀腺癌組織中LZTS2 mRNA高表達與患者預后密切相關，可成為甲狀腺癌預后的評估指標。

腫瘤進展中伴有多條信號通路異常激活或失活，Wnt/β-catenin、表皮生長因子受體(EGFR)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)是經典癌癥信號通路，已被證實參與甲狀腺癌的發生和發展[17，20-21]。ERBB3是EGFR家族的一員，當ERBB3過表達或基因擴增時，能激活下游Wnt/β-catenin、EGFR、PI3K/Akt等信號通路，充當多種惡性腫瘤的促癌基因而促進腫瘤的惡性進展[22-23]。本研究結果顯示，甲狀腺癌組織中ERBB3 mRNA表達水平上調，且不同TNM分期和有無淋巴結轉移甲狀腺癌患者ERBB3 mRNA表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示ERBB3在甲狀腺癌中發揮促癌基因作用，考慮與ERBB3能激活Wnt/β-catenin、PI3K/Akt等信號通路有關。有研究顯示，甲狀腺癌患者PI3K、EGFR基因明顯富集于ERBB3高表達患者中[24]。本研究結果顯示，ERBB3 mRNA高表達組總生存率明顯降低，說明甲狀腺癌組織中ERBB3 mRNA高表達與患者預后密切相關，可成為甲狀腺癌預后的評估指標。

綜上所述，甲狀腺癌組織中FN1 mRNA、ERBB3 mRNA呈高表達，LZTS2 mRNA呈低表達，與TNM分期、淋巴結轉移有關，可作為甲狀腺癌預后的評估指標。但本研究樣本量較少，有關FN1、LZTS2、ERBB3參與甲狀腺癌的機制有待進一步研究。