miR-221-5p、miR-126在腎細胞癌中的相對表達水平及其對預后的預測價值*

林龍輝，莊巧斐

中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇九醫院腎臟內科，福建漳州 363000

腎細胞癌(RCC)在全球患病率呈逐年增高趨勢，75%～80%的患者為透明細胞RCC，早期無典型表現，約1/3的患者就診時已出現轉移，錯過了最佳手術干預時機，即便行根治性手術治療，術后復發仍較常見[1]。RCC病因比較復雜，包括肥胖、吸煙、家族遺傳史等，進展與轉移機制也非常復雜[2]。臨床急需尋求相關標志物對RCC病情進行評估，并預測其預后，尋找一種有效方式提高RCC的診療水平。有研究發現，微小核糖核酸(miR)可利用靶基因對細胞周期進行調控，發揮促癌與抑癌作用，影響腫瘤進展及轉移[3]。有研究顯示，miR-221在RCC中表達水平異常增高，并且與這類患者的臨床病理學特征有關[4]，表明miR-221可能與RCC的病情相關。而miR-221-5p是由miR-221前體的5′端臂加工而來，可能在腫瘤疾病中具有重要的調節作用，但其在RCC中的作用機制及與預后的關系尚未明確，還有待進一步探討。有研究發現，miR-126在前列腺癌、胰腺癌、RCC等惡性腫瘤中均可見信號通路富集，其表達水平異?？赡芘c多種惡性腫瘤的發生有關[5]。基于上述研究背景，本研究旨在觀察miR-221-5p、miR-126在RCC組織中的相對表達水平及其與預后的關系，以便協助RCC的診療，改善其預后，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2016年7月至2018年7月收治的134例RCC患者作為研究對象，其中男75例，女59例；年齡30～73歲，平均(55.21±13.96)歲；組織類型：乳頭狀癌23例，透明細胞癌97例，其他14例；腫瘤最大徑：≥4 cm 59例，<4 cm 75例；Fuhrman分級：Ⅰ～Ⅱ級97例，Ⅲ～Ⅳ級37例；淋巴結轉移：有淋巴結轉移29例，無淋巴結轉移105例；美國癌癥聯合會(AICC)分期：Ⅰ期68例，Ⅱ期49例，Ⅲ/Ⅳ期17例。本研究方案獲得本院倫理委員會批準。納入標準：通過病理診斷確診為RCC的患者；年齡≥18歲的患者；既往無免疫治療及放化療史的患者；術前檢查及病歷資料均完善的患者；意識清醒、精神狀態正常的患者；遵循自愿原則，并簽署知情同意書的患者。排除標準：既往患其他原發性腫瘤的患者；有嚴重基礎疾病的患者，例如心肌梗死、腦梗死等；有血液系統疾病的患者；近1個月內使用過免疫抑制劑、激素類藥物的患者。

1.2方法

1.2.1miR-221-5p、miR-126檢測 通過手術獲取患者RCC組織、癌旁組織(距離病灶約3 cm)，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測miR-221-5p、miR-126相對表達水平。主要試劑為無水乙醇、飽和酚、瓊脂糖、β-巰基乙醇、反轉錄試劑、Trizol試劑，均購自美國Thermo公司。主要儀器為5424R型離心機(德國Eppendorf股份公司)、7500型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)、Nanodrop ND-1000型分光光度計(美國Thermo Fisher公司)。采用Trizol法提取總RNA，取少量RNA檢測純度與濃度，其余置于-70 ℃環境備用。行反轉錄反應，根據要求加入反轉錄試劑，在37 ℃下反應60 min，在85 ℃下加入滅活酶，時間5 min，合成cDNA，置于-20 ℃環境下。行qRT-PCR檢測，反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火2 s，72 ℃延伸10 s，40個循環。引物序列：(1)miR-221-5p上、下游序列分別為5′-GCTACATTGTCTGCTTGGGTTTCA-3′、5′-GT GCAGGGTCCGAGGT-3′。(2)miR-126上、下游序列分別為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′、5′-ATTCGCACTGGATACGACCGCATT-3′。(3)內參引物U6上、下游序列分別為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用2-ΔΔCt表示miR-221-5p、miR-126相對表達水平。

1.2.2隨訪分析 從患者術后第1天開始隨訪，時間為3年，通過電話、微信等方式進行，記錄患者3年累積生存率。

2 結 果

2.1RCC組織和癌旁組織中miR-221-5p、miR-126相對表達水平比較 RCC組織中miR-221-5p相對表達水平高于癌旁組織，而miR-126相對表達水平低于癌旁組織，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 RCC組織和癌旁組織中miR-221-5p、miR-126相對表達水平比較

2.2不同病理特征與miR-221-5p、miR-126表達情況比較 根據RCC組織內miR-221-5p、miR-126表達水平均值分為高表達組(≥均值)和低表達組(<均值)。miR-221-5p高表達組腫瘤最大徑≥4 cm、Fuhrman分級為Ⅲ～Ⅳ級、有淋巴結轉移、AICC分期為Ⅲ/Ⅳ期占比均高于低表達組，miR-126低表達組腫瘤最大徑≥4 cm、Fuhrman分級為Ⅲ～Ⅳ級、有淋巴結轉移、AICC分期為Ⅲ/Ⅳ期占比均高于高表達組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同病理特征與miR-221-5p、miR-126表達情況比較[n(%)]

2.3miR-221-5p、miR-126表達水平與患者預后的關系 miR-221-5p高表達組3年累積生存率為59.72%(43/72)，低表達組3年累積生存率為83.87%(52/62)，miR-221-5p高表達組3年累積生存率低于低表達組，差異有統計學意義(log-rankχ2=9.415，P<0.05)。見圖1。miR-126高表達組3年累積生存率為80.00%(56/70)，低表達組3年累積生存率為60.94%(39/64),miR-126高表達組3年累積生存率高于低表達組，差異有統計學意義(log-rankχ2=5.888，P<0.05)。見圖2。

圖1 miR-221-5p高表達組和低表達組累積生存率比較

圖2 miR-126高表達組和低表達組累積生存率比較

2.4生存組和死亡組miR-221-5p、miR-126相對表達水平比較 根據患者生存和死亡情況分為生存組和死亡組，生存組miR-221-5p相對表達水平低于死亡組，miR-126相對表達水平高于死亡組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 生存組和死亡組miR-221-5p、miR-126相對表達水平比較

2.5miR-221-5p、miR-126相對表達水平對RCC預后的評估價值 miR-221-5p、miR-126單獨檢測預測RCC預后的AUC分別為0.758、0.791，二者聯合檢測預測RCC預后的AUC為0.852，見表4、圖3。

表4 miR-221-5p、miR-126相對表達水平對RCC預后的評估價值

圖3 miR-221-5p、miR-126相對表達水平評估RCC預后的ROC曲線

3 討 論

RCC在腎臟惡性腫瘤中占比為80%～90%，典型表現為局部腫塊、血尿及疼痛。目前，外科手術仍然是治療RCC的主要方法，在患者無手術禁忌證的情況下，通常主張行手術切除，然而即便如此，患者術后復發率仍較高，為20%～40%，對生命質量影響非常大[6]。近年來，臨床陸續出現了一系列輔助治療方法，如靶向治療、物理治療、射頻消融治療、微波消融治療等，這些方法雖有一定價值，但療效非常有限，預后尚不夠理想[7]。RCC早期診斷和治療比較困難，多數患者就診時已進展為中晚期，這也是導致預后差的重要因素。因此，盡早診斷和治療是降低復發率及病死率，改善預后的關鍵。有研究表明，miRNA在RCC、乳腺癌、肺癌等疾病中發揮重要調節作用，其基因缺失或突變可引起異常表達，從而影響細胞凋亡、增殖、代謝、分化等，在癌癥中起抑癌或促癌作用[8]。臨床通過分析相關miRNA在RCC中的表達意義，可能對RCC的預后預測有一定作用。

有研究表明，miR-221-5p經轉錄后能通過靶向細胞因子信號傳導抑制蛋白1對癌細胞遷移、增殖進行調節，還能調控有絲分裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶信號通路在腫瘤中發揮作用[9]。另有學者發現，長非編碼RNA-ATB能通過調控腫瘤抑制因子miR-126，參與腫瘤細胞遷移與增殖[10]。由此表明miR-221-5p、miR-126對腫瘤細胞具有調控作用，臨床有必要進一步分析二者對RCC患者病情及預后的影響，為RCC的治療提供依據。本研究結果顯示，與癌旁組織比較，RCC組織中miR-221-5p相對表達水平上調，miR-126相對表達水平下調，表明二者異常表達與RCC有關。miR-221-5p在惡性腫瘤中具有促癌作用，涉及的機制比較復雜，可受RNF185-AS1調控，促進肝癌進展[11]。TRILLA-FUETES等[12]研究發現，RCC組織中miR-221-5p呈過度表達，進一步提示高表達的miR-221-5p能促進RCC的進展。miR-126是一種腫瘤抑制因子，張玉潔等[13]研究發現，miR-126在非小細胞肺癌患者血清中表達水平降低，提示其在這類癌癥中有抑癌作用。蔣莉萍等[14]研究發現，miR-126在胃癌中有抑癌功能，它能通過對高爾基體磷蛋白3進行靶向調節，抑制癌細胞增殖。此外，miR-126與RCC之間也存在密切關聯，能下調Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶1(ROCK1)表達水平，對RCC細胞的侵襲與遷移、增殖進行抑制，在RCC中有抑癌作用[15]。

RCC的病理特征比較復雜，并且部分miRNA與RCC的病理特征密切相關[16]。本研究結果提示，RCC患者miR-221-5p、miR-126表達情況與腫瘤最大徑、Fuhrman分級、淋巴結轉移、AICC分期均有關，這可能是因為miR-221-5p的促癌功能與miR-126的抑癌功能所致。miR-221-5p在RCC中具有促癌作用，可促進腫瘤生長，影響Fuhrman分級與AICC分期，增加淋巴結轉移風險；而miR-126在RCC中有抑癌作用，能抑制腫瘤生長，控制病情進展。RCC惡性程度高，預后差，RCC患者術后的預后因素主要與腫瘤AICC分期高、Fuhrman分級高、有淋巴結轉移、腫瘤最大徑比較大等有關，上述均為常規因素[17]。本研究發現，miR-221-5p、miR-126相對表達水平與RCC預后密切相關，miR-221-5p低表達與miR-126高表達患者3年累積生存率更高，且二者對預后有一定評估價值。miR-221-5p是miR-221前體的5′端臂加工后的產物，miR-221與RCC進展密切相關，它能通過靶向抑制基質金屬蛋白酶2的組織抑制物表達，促進RCC細胞轉移、增殖及侵襲[18]，間接提示miR-221-5p可能參與了RCC的進展。除此之外，miR-221異常表達會影響RCC患者舒尼替尼治療的反應[19]，間接提示其能影響RCC的治療效果。miR-126則能通過靶向調節ROCK1表達，抑制RCC進展，這可能是其異常表達影響預后的重要原因。臨床有望通過檢測miR-221-5p、miR-126相對表達水平對RCC預后進行預測，并將二者作為RCC的診療靶標。

綜上所述，RCC患者miR-221-5p相對表達水平上調，miR-126相對表達水平下降，二者異常表達可降低3年累積生存率，對預后影響非常大。本研究局限性為納入樣本量較少，并且尚未進一步明確miR-221-5p、miR-126的靶基因，未來還需對此進行更深入的闡述。