MDR1、SOX4、WT1在急性髓系白血病中的作用及表達水平*

耿 雪，張建華，陳 艾

1.西部戰區總醫院檢驗科，四川成都 610000；2.重慶醫科大學附屬第三醫院檢驗科，重慶 401120

急性髓系白血病(AML)是一組高度異質性、惡性、克隆性血液腫瘤，由骨髓增生異常綜合征、骨髓增殖性腫瘤等血液相關疾病及腫瘤相關放化療引起[1]。AML發病涉及多種基因融合和突變，基因組學改變與AML的發病、發展和預后有明確的相關性[2]。多藥耐藥基因(MDR1)是調控腫瘤耐藥的基因，其表達可促使癌細胞對抗腫瘤治療產生耐藥，導致治療失敗、腫瘤復發轉移及預后不良[3]。SOX4是SOX轉錄因子家族成員，在細胞生長發育，以及惡性腫瘤細胞增殖、擴散中均發揮重要作用[4]。Wilms瘤基因1(WT1)是一種有效的轉錄調節因子，與腫瘤細胞的生長、侵襲、轉移和血管生成相關[5]。本研究擬探討MDR1、SOX4、WT1在AML中的表達特點，分析其與AML臨床特征及預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2021年8月本院收治的149例AML患者作為AML組，其中男89例，女60例；年齡50～68歲，平均(59.25±4.27)歲；AML分型：M1型12例，M2型85例，M3型15例，M4型16例，M5型20例，M6型1例。納入標準：(1)經骨髓細胞形態學檢查確診為AML，符合2016年世界衛生組織制定的造血和淋巴組織腫瘤診斷標準[6]；(2)年齡18歲以上。排除標準：(1)淋巴細胞白血病、慢性髓系白血病、骨髓瘤、淋巴瘤等其他血液系統疾病患者；(2)合并實體腫瘤患者；(3)入組前接受過化療、免疫或靶向治療的患者。另選取同期于本院行骨髓檢查無明顯異常的72例輕度貧血(血紅蛋白90～120 g/L)患者作為對照組，其中男42例，女30例；年齡48～69歲，平均(59.07±4.31)歲。AML組和對照組性別、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已經獲得本院倫理委員會批準，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2骨髓MDR1、SOX4、WT1檢測方法 取骨髓穿刺獲得的骨髓組織標本2～3 mL，分離白細胞，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞。常溫下以1 500 r/min離心(離心半徑10 cm)5 min，棄上清液。采用Wizard?SV Genomic DNA Purification Kit組織DNA提取試劑盒(美國Promega生物公司)提取RNA，采用cDNA試劑盒(美國賽默飛公司)將RNA反轉錄為cDNA，取2 μL cDNA樣品加入實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)體系，采用CFX96實時定量PCR系統(美國BIO-RAD公司)進行PCR。引物由上海捷瑞公司合成，引物序列如下。MDR1 mRNA上游：5′-GCTGTCAAGGAAGCCAATGCCT-3′；下游：5′-TGCAATGGCGATCCTCTGCTTC-3′。SOX4 mRNA上游：5′-GTGAGCGAGATGATCTCGGG-3′；下游：5′-CAGGTT GGAGATGGACTC-3′。WT1 mRNA上游：5′-ACAGGGTACGAGAGCGATAACCA-3′；下游:5′-CACACGTCGCACATCCTGAAT-3′。β-actin(內參)上游：5′-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′；下游：5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′。反應體系，DNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，Premix Ex Taq DNA 聚合酶25 μL，RNase-Free ddH2O 21 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min，98 ℃變性2 s，67 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，循環30次。采用2-ΔΔCt的方法計算MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA相對表達水平。

1.3隨訪 出院后電話隨訪至2021年10月，統計隨訪期間總生存情況，總生存時間為自病理確診到全因死亡或隨訪結束。

2 結 果

2.1AML組和對照組骨髓組織中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達水平比較 AML組骨髓組織中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達水平均高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 AML組和對照組骨髓組織中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達水平比較

2.2不同臨床特征AML患者骨髓組織中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達水平比較 白細胞計數≥40×109/L、有器官浸潤、治療后非完全緩解AML患者骨髓組織中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達水平均高于白細胞計數<40×109/L、無器官浸潤及治療后完全緩解患者，差異均有統計學意義(P<0.05)；不同年齡、性別、AML分型、血小板計數患者MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同臨床特征AML患者骨髓組織中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達水平比較

2.3不同MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達水平AML患者總生存率比較 149例AML患者隨訪期間失訪5例，余144例中死亡48例，MDR1 mRNA、SOX4 mRNA及WT1 mRNA高表達AML患者總生存率均低于MDR1 mRNA、SOX4 mRNA及WT1 mRNA低表達AML患者，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1、表3。

注：A為不同MDR1 mRNA表達水平患者生存曲線；B為不同SOX4 mRNA表達水平患者生存曲線;C為不同WT1 mRNA表達水平患者生存曲線。

表3 不同MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達水平AML患者總生存率比較[n(%)]

2.4影響AML患者預后的單因素Cox比例風險回歸分析 以AML患者生存情況作為因變量，納入年齡、性別、AML分型、白細胞計數、血小板計數、器官浸潤、治療后緩解情況、MDR1 mRNA表達水平、SOX4 mRNA表達水平、WT1 mRNA表達水平作為自變量(表4)。單因素Cox比例風險回歸分析(ENTER法)結果顯示，有器官浸潤、治療后非完全緩解、MDR1 mRNA高表達、SOX4 mRNA高表達、WT1 mRNA高表達與AML患者預后有關(P<0.05)，見表5。將單因素分析中差異有統計學意義的項目納入多因素Cox比例風險回歸分析(ENTER法)，結果顯示，治療后非完全緩解、MDR1 mRNA高表達、SOX4 mRNA高表達、WT1 mRNA高表達是AML患者預后不良的危險因素(P<0.05)，見表6。

表4 賦值表

表5 影響AML患者預后的單因素Cox比例風險回歸分析

表6 影響AML患者預后的多因素Cox比例風險回歸分析

3 討 論

AML是一組高病死率的惡性腫瘤，由骨髓干細胞克隆異常增殖和分化引起，發病機制涉及遺傳、環境改變、染色體易位及基因突變等，大多數患者出現白細胞增多伴骨髓衰竭跡象(貧血和血小板減少)及疲勞、厭食和體質量減輕，少數患者可出現淋巴結腫大和器官腫大，如果不及時治療，通常會在診斷后數月內因感染或出血而死亡[1]。過去40年，AML的治療一直局限于高劑量細胞毒性化療，近年來，隨著深度測序技術的發展和靶向藥物的應用，具有更高療效的化療和更低毒性的靶向療法逐漸應用于臨床，但是靶向藥物耐藥、治療毒性疊加效應等給治療帶來新的挑戰[7]，患者預后仍然不是十分理想[8]。

MDR1是一種三磷酸腺苷(ATP)依賴性跨膜轉運蛋白，由ABCB1基因編碼，位于染色體區域7q21上，在腸道、結腸、胎盤、肝臟、血腦屏障等多種組織中表達，通過減少敏感器官或細胞中異生物質的積累發揮保護作用[9]。MDR1編碼的糖蛋白是一種糖基化膜蛋白，屬于膜轉運蛋白的ATP結合超家族成員，嵌于細胞膜上，作為膜通道可將細胞內底物泵出細胞外，降低細胞內藥物濃度，進而產生耐藥[10]。MDR1在腫瘤細胞中充當化療藥物外排泵，是癌細胞對化療耐藥的主要機制之一。有研究結果顯示，MDR1多態性可改變蛋白質表達或功能，與結直腸癌化療藥物反應性有關[11]。MDR1基因表達增加降低癌細胞中具有細胞毒性的抗癌藥物濃度，并導致多藥耐藥表型，與神經母細胞瘤、乳腺癌等多種癌癥化療后預后不良有關[12]。本研究結果顯示，AML患者骨髓中MDR1 mRNA表達水平增加，并且其高表達與白細胞計數增加、有器官浸潤、治療后非完全緩解及預后不良有關，說明MDR1 mRNA高表達與AML進展、治療反應性差及預后不良有關。KASSEM等[13]在報道中指出，MDR1基因表達水平在AML耐藥患者中明顯升高，MDR1基因高表達與低完全緩解率和低生存率有關。推測MDR1可能通過誘導AML對抗腫瘤治療耐藥參與其進展過程。

SOX家族由參與細胞和器官發育分化及癌癥發生和發展的轉錄因子組成，SOX4是SOX家族中一種重要的發育轉錄因子，含474個氨基酸殘基，參與骨和心臟等器官發育，與骨質疏松癥、癌癥等多種疾病有關[14]。目前，已知SOX4在20多種惡性腫瘤中呈高表達，通過與其他轉錄因子相互作用促進癌細胞存活、上皮間充質轉化、癌細胞遷移和轉移[15]。有研究顯示，SOX4可直接或間接負調節 WNT5a水平，增加膀胱癌細胞侵襲性[16]，在晚期前列腺癌中，SOX4通過靶向上調miR-17-92表達水平，下調RB1蛋白表達水平，促使癌細胞增殖[17]。本研究發現，SOX4 mRNA在AML患者骨髓中呈高表達，是AML預后不良的危險因素，表明SOX4在AML中發揮致癌基因作用。LU等[18]研究認為，SOX4是急性白血病發病的重要啟動因子，與AML患者預后不良獨立相關。SOX4可能通過調控磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路參與AML的發病過程[19]，也可能誘導Rho GTPase激活蛋白9表達上調，促使AML細胞增殖，抑制其凋亡，促使癌癥進展[20]。

WT1最初被鑒定為Wilms腫瘤的候選基因，進一步研究表明，WT1可調節一系列靶基因和信號途徑參與細胞發育、器官形成、組織穩態維持及疾病發病過程[21]。有研究表明，WT1 mRNA在乳腺癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌等多種惡性腫瘤中異常表達，發揮致癌基因作用，在乳腺癌中WT1 mRNA表達水平增加，抑制WT1 mRNA表達水平可降低細胞周期蛋白D1表達，抑制癌細胞增殖，促使癌細胞凋亡[22]。WT1 mRNA在多形性膠質母細胞瘤中呈高表達，發揮促進癌細胞增殖和遷移作用[23]。本研究發現，WT1 mRNA在AML中表達水平增加，WT1 mRNA高表達與AML患者預后有關，證明WT1在AML中發揮致癌基因作用。PANDEY等[24]研究結果顯示，WT1 mRNA在急性早幼粒細胞白血病患者骨髓樣本中表達水平增加，WT1 mRNA高表達可上調白血病細胞中細胞周期蛋白A1 mRNA表達水平，促進癌細胞增殖。

綜上所述，AML患者骨髓組織中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表達水平均增加，Cox比例風險回歸分析結果顯示，MDR1 mRNA高表達、SOX4 mRNA高表達、WT1 mRNA高表達與AML患者預后不良有關，提示MDR1、SOX4、WT1均參與了AML的發病機制，可為AML病情評估、預后預測及靶向治療提供參考。本研究局限之處在于隨訪時間過短，MDR1、SOX4、WT1與AML患者預后的關系尚有待進一步延長隨訪時間加以證實。