MMP-3、ORMDL3基因多態性與兒童呼吸道合胞病毒感染性毛細支氣管炎的相關性研究*

丁 波，楊新軍，李智敏，李雅莉

三二〇一醫院兒科，陜西漢中 723000

毛細支氣管炎是2歲以下嬰幼兒常見的呼吸道感染性疾病，以1～6個月嬰兒多發，最常見的病原體是呼吸道合胞病毒(RSV)[1]。據相關報道，1/3～1/2的毛細支氣管炎患兒后期會進展為哮喘，RSV感染性毛細支氣管炎患兒罹患哮喘的概率明顯增加[2]。有研究發現，遺傳因素是哮喘的基本病因，毛細支氣管炎患者患病后3年發生哮喘的概率達54%，認為其與哮喘存在共同的遺傳基礎[3]。有研究表明，基因多態性與RSV感染后哮喘的發生存在相關性，提示遺傳因素在毛細支氣管炎的發生和發展中有重要作用[4]。既往有研究證實，位于17q21染色體的血清類黏蛋白1樣蛋白質3(ORMDL3)基因多態性與兒童哮喘相關，以單核苷酸多態性(SNP)rs7216389位點為主要代表，被認為是哮喘的標志性基因[5]。基質金屬蛋白酶(MMP)是一種蛋白水解酶，有研究表明其家族異常表達與哮喘患兒氣道高反應和病情嚴重程度有關，證實MMP-9基因多態性與嬰幼兒慢性炎癥性疾病有關[6]。RSV感染性毛細支氣管炎疾病易感性與MMP-3啟動子區1171 5A/6A基因、1171 6A/6A基因多態性及MMP-9啟動子區1562 C/T基因多態性有關，證實MMPs基因多態性在兒童RSV感染性毛細支氣管炎的發生和發展中意義重大[7]。基于此，本研究擬探討MMP-3、ORMDL3基因多態性與兒童RSV感染性毛細支氣管炎病情嚴重程度及疾病易感性的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2021年5月本院收治且診斷為RSV感染性毛細支氣管炎的63例患兒作為觀察組，其中男36例，女27例，平均年齡(8.2±2.4)個月。參照呼吸系統評分標準[8]進行病情評估后將觀察組又分為輕度組[20例(<7分)]、中度組[30例(7～9分)]和重度組[13例(>9分)]。另選取同期配對的50例健康體檢兒童作為對照組，其中男30例，女20例，平均年齡(7.9±2.3)個月，無毛細支氣管炎、哮喘病史及相關家族史。兩組性別、年齡比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得本院醫學倫理委員會批準，家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2納入和排除標準 納入標準：毛細支氣管炎診斷參考《毛細支氣管炎診斷、治療與預防專家共識(2014年版)》[9]中的標準，鼻拭子RSV抗原檢測呈陽性；年齡2～24個月，既往無哮喘病史；臨床資料完整。排除標準：支氣管、肺組織發育不良，以及先天性心臟病和心血管畸形等基礎疾病；早產及雙胎；合并免疫缺陷疾病或使用免疫抑制劑、激素的患兒；過敏性疾病家族史；心肺等重要臟器功能不全；合并其他慢性呼吸道疾病等。

1.3方法

1.3.1儀器與試劑 9700型聚合酶鏈反應(PCR)儀、3730XL DNA測序儀(美國ABI公司)；離心機(PMC-860，美國Tomy公司)；MassARRAY Typer系統(美國Sequenom公司)；反轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)；合成引物及探針[中國寶生物(大連)工程有限公司]。

1.3.2PCR-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)檢測MMP-3、ORMDL3基因多態性 采集所有受試者外周靜脈血約3 mL，抗凝，以3 000 r/min離心10 min，取血清保存，送檢；采用DNA檢測試劑盒提取DNA，采用PCR-RFLP檢測MMP-3、ORMDL3基因多態性。根據Primer-Blast軟件設計基因引物序列，采用Blast進行引物比對以減少非特異性擴增，見表1；PCR反應體系：DNA模板1.0 μL，引物1.0 μL，10×Taq緩沖液2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，Taq酶0.2 μL，加ddH2O至總體積為20.0 μL；PCR反應條件:95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，循環35次；37 ℃對PCR產物進行酶切，采用MassARRAY Typer系統分析基因分型，操作步驟按照檢測試劑盒及儀器說明書進行。

表1 MMP-3、ORMDL3基因SNP引物序列

2 結 果

2.1SNP基因型分布平衡檢驗 rs522616、rs679620、rs7216389、rs2603332基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P=0.856、0.648、0.574、0.348)，表明該樣本基因頻率已達到遺傳平衡，具有群體代表性。

2.2MMP-3基因多態性分析

2.2.1觀察組和對照組MMP-3基因rs522616、rs679620位點基因型和等位基因分布情況比較 觀察組MMP-3基因rs522616位點基因型和等位基因分布情況與對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；MMP-3基因rs679620位點基因型和等位基因分布情況與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，其中AG基因型和A等位基因頻率均明顯高于對照組，GG基因型和G等位基因頻率均明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 觀察組和對照組MMP-3基因rs522616、rs679620位點基因型和等位基因分布情況比較[n(%)]

2.2.2輕度組、中度組和重度組MMP-3基因rs522616、rs679620位點基因型和等位基因分布情況比較 MMP-3基因rs522616位點基因型和等位基因分布情況與觀察組患兒病情嚴重程度和疾病易感性均無明顯相關性(P>0.05)；MMP-3基因rs679620位點基因型和等位基因分布情況與觀察組患兒病情嚴重程度和疾病易感性均明顯相關(P<0.05)，重度組MMP-3基因rs679620位點AG基因型頻率均明顯高于輕度組和中度組，差異均有統計學意義(P<0.05)，其等位基因分布情況在不同嚴重程度組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 輕度組、中度組和重度組MMP-3基因rs522616、rs679620位點基因型和等位基因分布情況比較[n(%)]

2.3ORMDL3基因多態性分析

2.3.1觀察組和對照組ORMDL3基因rs7216389、rs2603332位點基因型和等位基因分布情況比較 觀察組ORMDL3基因rs7216389位點基因型和等位基因分布情況與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，其中TT基因型和T等位基因頻率均明顯高于對照組，CT基因型和C等位基因頻率均明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；觀察組ORMDL3基因rs2603332位點基因型和等位基因分布情況與對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 觀察組和對照組ORMDL3基因rs7216389、rs2603332位點基因型和等位基因分布情況比較[n(%)]

2.3.2輕度組、中度組和重度組ORMDL3基因rs7216389、rs2603332位點基因型和等位基因分布情況比較 ORMDL3基因rs7216389位點基因型和等位基因分布情況與疾病易感性明顯相關(P<0.05)，與病情嚴重程度無關(P>0.05);ORMDL3基因rs2603332位點基因型和等位基因分布情況與疾病易感性和病情嚴重程度均無明顯相關性(P>0.05)，見表5。

表5 輕度組、中度組和重度組ORMDL3基因rs7216389、rs2603332位點基因型和等位基因分布情況比較[n(%)]

3 討 論

毛細支氣管炎作為嬰幼兒常見的下呼吸道感染性疾病，據流行病學報道顯示，約70%的患兒出生后1～12個月會發生RSV感染，約90%以上的2歲幼兒均感染過RSV，RSV亦是毛細支氣管炎后期進展為哮喘的重要危險因素[2,10]。因此，由RSV引發的各類兒童疾病目前仍是公共衛生領域研究的重點方向。基因多態性是指同一個生物群體中存在兩種或多種不連續的變異型或基因型或等位基因[8]。隨著對基因遺傳學的深入研究，人們逐漸意識到疾病易感性及病情嚴重程度與基因遺傳多態性關系密切，發現多個RSV感染性毛細支氣管炎遺傳易感標記，如編碼白細胞介素(IL)-4、IL-8和表面活性蛋白的基因、白三烯C4等[11]，這表明人類基因多態性在闡明人體對疾病易感性、疾病臨床表現的多樣性及遺傳性疾病的分子機制中有重大意義，與致病基因連鎖的多態性位點可作為遺傳病的診斷標記。毛細支氣管炎后繼發哮喘具有家族聚集性，RSV感染性毛細支氣管炎與哮喘具有共同的遺傳易感性[3]。近年來，基因多態性與臨床表型多樣性的聯系逐漸受到廣泛關注，因此,積極探討基因SNP與毛細支氣管炎易感性及病情嚴重程度的相關性有重要意義。

人類遺傳過程中SNP是一種常見的形式，DNA序列多態性可引起個體對病原菌感染的易感性發生差異[12]。MMPs是一種蛋白水解酶，目前已知的有1～28號，主要對細胞外基質起降解和調節其動態平衡的作用，對轉錄水平中的表達調控作用至關重要[13]。MMP-3是MMPs家族的關鍵酶，目前有關其基因多態性的研究主要以2號外顯子rs679620位點、5′端轉錄調控區rs522616位點及啟動子區1171 5A/6A位點為主，發現MMP-3基因上的SNP rs522616和rs679620位點的基因型和等位基因的改變可能會導致不同人群MMPs活性及表達不同，導致某些疾病在不同人群中的嚴重性及易感性存在差異，證實MMP-3基因多態性在肺部疾病的發生和發展中起重要作用。在RSV感染性疾病的研究中，HIRAKAWA等[14]在RSV感染的人鼻黏膜上皮細胞中證實RSV感染會促進MMP-3表達。SCHUURHOF等[15]研究發現，RSV感染性毛細支氣管炎患兒rs522616位點等位基因A頻率明顯升高，提示其多態性與RSV感染密切相關，該位點等位基因A可能通過促進MMP-3表達，引起MMP-3及其組織抑制劑表達失衡，加重肺組織損傷，進而造成RSV感染。吳用等[7]報道顯示，MMP-3的1171 5A/6A基因和1171 6A/6A基因多態性與RSV感染性毛細支氣管炎易感性相關。本研究通過對MMP-3基因上的rs679620、rs522616位點檢測發現，觀察組患兒MMP-3基因rs679620位點AG基因型和A等位基因頻率均明顯高于對照組，且重度組AG基因型頻率均明顯高于輕度組和中度組，表明MMP-3基因rs679620位點多態性與RSV感染性毛細支氣管炎疾病易感性和病情嚴重程度均明顯相關，攜帶AG基因型和A等位基因的患兒更易發病且病情較重；MMP-3基因rs522616位點基因型和等位基因分布在不同組間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，但并不表明其多態性對RSV感染性毛細支氣管炎的發生和發展無明顯影響。鑒于RSV感染性毛細支氣管炎病理機制復雜，本研究納入部分樣本進行分析，MMP-3基因rs522616位點基因表達不可避免可能受其他未知多因素的影響，還需進一步深入探討。

ORMDL3基因能夠通過改變內質網Ca2+濃度，促進非折疊蛋白反應，是內在的炎癥通路[16]。有研究證實，ORMDL3基因SNP與兒童哮喘關系密切，發現其rs7216389位點堿基C→T的改變可影響ORMDL3表達，而rs4794820位點參與氣道高反應性調節及上皮細胞炎癥，在哮喘發病中作用明顯[5]。王玲等[17]研究報道顯示，ORMDL3上的rs7216389 C等位基因是哮喘的保護基因，T等位基因是哮喘的易感基因。劉麗紅等[18]研究發現，哮喘患者SNP rs7216389位點TT基因型和T等位基因頻率均明顯高于健康人群，是哮喘發病的高危基因型。胡慧婷等[19]研究發現，GSDMB/ORMDL3基因上的rs4794820位點AA基因型和rs7216389位點CC基因型降低了哮喘的發病風險，rs4794820位點GG基因型和rs7216389位點TT基因型則提高了哮喘的發病風險。本研究分析了ORMDL3基因的SNP rs7216389和rs2603332位點與RSV感染性毛細支氣管炎的關系顯示，觀察組患兒ORMDL3基因rs7216389位點TT基因型和T等位基因頻率均明顯高于對照組，但與病情嚴重程度無明顯相關性，提示ORMDL3基因rs7216389位點是哮喘與毛細支氣管炎易感性的共同遺傳基因，TT基因型是二者發病的高危基因型；ORMDL3基因rs2603332位點基因型和等位基因分布與RSV感染性毛細支氣管炎疾病易感性和病情嚴重程度均無相關性，證實ORMDL3基因多態性僅與毛細支氣管炎易感性有關，與病情嚴重程度無明顯相關性。本研究結果表明，MMP-3、ORMDL3基因多態性與RSV感染性毛細支氣管炎發病關系密切，對其SNP位點的研究有助于評估毛細支氣管炎患兒對RSV的疾病易感性和病情嚴重程度，也可為毛細支氣管炎的預防和治療提供更多分子標志物，具有積極的臨床意義。此外，基因的SNP位點一般具有多個，本研究分別選取了與哮喘相關性較強的2個SNP位點，并探討其與RSV感染性毛細支氣管炎的關系，故對于MMP-3、ORMDL3基因多態性與RSV感染性毛細支氣管炎發生和發展的關系還需從不同角度繼續進行探討。

MMP-3基因rs679620位點多態性及AG基因型與疾病易感性和病情嚴重程度均有關；ORMDL3基因rs7216389位點多態性與疾病易感性有關。MMP-3、ORMDL3基因多態性檢測對兒童RSV感染性毛細支氣管炎疾病易感性和病情嚴重程度評估具有臨床指導意義。