湖南省奶牛源金黃色葡萄球菌分離鑒定與耐藥性分析

周汝順，寧柯銘，江 燕，肖安東，劉曙光*

(1.湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，長(zhǎng)沙 410006；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)沙 410128)

奶牛乳房炎是近年來(lái)危害奶業(yè)發(fā)展的重要疾病，而金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)被證明是引起奶牛乳房炎最常見的病原菌之一，主要通過定植、黏附于家畜的乳腺上皮細(xì)胞，導(dǎo)致母牛乳腺膿腫、硬化或瘺管[1-2]；病畜可見明顯的乳房發(fā)熱、發(fā)硬、疼痛，產(chǎn)出微紅至黑色的帶有惡臭絮狀物的乳汁，嚴(yán)重時(shí)可能危害到病畜生命；或是影響牛奶品質(zhì)，造成食物中毒，嚴(yán)重危害食品安全和公共衛(wèi)生安全。目前，對(duì)于金黃色葡萄球菌引起的感染主要通過抗菌藥物進(jìn)行治療，然而，隨著抗菌藥物的大量使用，金黃色葡萄球菌通過自身表型及代謝通路的改變對(duì)抗菌藥物逐漸產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥，同時(shí)還可以通過水平轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因，從而對(duì)各種抗菌藥物表現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致多重耐藥菌株出現(xiàn)，并快速傳播[3]。尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)自發(fā)現(xiàn)以來(lái)感染幾乎遍布全球，MRSA除了對(duì)新型半合成β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物具有耐藥性之外，還能抵抗大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類及喹諾酮類等多種抗菌藥物的作用，是名副其實(shí)的“超級(jí)細(xì)菌”[4-5]。近年來(lái)，苯唑西林敏感-mecA基因陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌 (Oxacillin-sensitivemecA-positive,OS-MRSA)在人醫(yī)臨床及動(dòng)物性食品檢測(cè)中頻頻被報(bào)道[6]，廣泛引起人們的關(guān)注，所以僅憑耐藥表型判斷MRSA具有一定局限性，需結(jié)合mecA基因檢出情況來(lái)區(qū)別OS-MRSA和苯唑西林耐受-mecA陽(yáng)性金黃色葡萄球菌(Oxacillin-resistantmecA-positive,OR-MRSA)。為了解湖南省奶牛源金黃色葡萄球菌的耐藥情況，本試驗(yàn)選用18種獸醫(yī)臨床常用抗菌藥物進(jìn)行耐藥性檢測(cè)并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以期為臨床合理用藥提供數(shù)據(jù)支撐和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株 金黃色葡萄球菌(ATCC29213)來(lái)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 樣品來(lái)源 257份牛乳樣品于2020-2021年采集自湖南長(zhǎng)沙、常德、邵陽(yáng)、永州、郴州等地奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.3 主要試劑與培養(yǎng)基 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自北京路橋技術(shù)股份有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；Vitek 2 GP細(xì)菌鑒定卡購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司；革蘭氏陽(yáng)性菌藥敏檢測(cè)板購(gòu)自天津金章科技發(fā)展有限公司；BTS標(biāo)準(zhǔn)品溶液、HCCA質(zhì)譜基質(zhì)溶液購(gòu)自德國(guó)BRUKER公司；Biospin 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自杭州博日科技股份有限公司;T3 Super PCR Mix購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司。

1.1.4 儀器 基質(zhì)輔助激光電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Miccroflex LH/SH，德國(guó)BRUKER公司)；全自動(dòng)生化鑒定儀(VITEK 2 Compact，法國(guó)梅里埃公司)；濁度計(jì)(VITEK 2，法國(guó)梅里埃公司)；PCR擴(kuò)增儀(T100，Bio-Rad公司)；光學(xué)顯微鏡(BX51，日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)增菌 吸取1 mL牛乳樣品加入10 mL 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯中，36 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 分離 將上述增菌后的液體培養(yǎng)物，劃線接種至金黃色葡萄球菌顯色平板上，于36 ℃培養(yǎng)24 h。挑取可疑菌落，接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，于36 ℃培養(yǎng)22 h，待進(jìn)一步細(xì)菌鑒定。

1.2.3 細(xì)菌鑒定

1.2.3.1 質(zhì)譜鑒定 取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的純化菌，均勻涂布于靶板樣品孔中，加70%甲酸溶液1 μL，晾干后加HCCA質(zhì)譜基質(zhì)溶液1 μL，混勻，晾干。同時(shí)用1 μL BTS標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對(duì)照，同法處理。將樣品靶板放入 質(zhì)譜儀，采集數(shù)據(jù)并處理。

1.2.3.2 生化鑒定

1.2.3.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將分離純化的疑似菌株進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢,觀察菌落形態(tài)。

1.2.3.2.2 觸酶反應(yīng) 取營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的新鮮菌株培養(yǎng)物，置潔凈載玻片上，滴加0.3%過氧化氫溶液1滴，觀察。

1.2.3.2.3 全自動(dòng)生化鑒定儀鑒定 將鏡檢和觸酶反應(yīng)陽(yáng)性的疑似菌株，挑取新鮮菌落至無(wú)菌生理鹽水中，調(diào)菌液濃度至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬瑢P細(xì)菌鑒定卡懸浮管插入菌懸液，按照VITEK 2 Compact鑒定儀操作上機(jī)處理。

1.2.4 藥敏檢測(cè) 按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)方法，采用肉湯稀釋法對(duì)分離菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，檢測(cè)其對(duì)青霉素等18種臨床上常見抗菌藥物的耐藥性。

挑取新鮮菌落于適量無(wú)菌水中，用濁度計(jì)調(diào)菌懸液濃度至 0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬?120 μL 菌懸液加入24 mL 肉湯，混勻，吸取100 μL肉湯菌懸液接種于含倍比稀釋藥物的革蘭氏陽(yáng)性菌藥敏檢測(cè)板中，空白對(duì)照孔中加入 100 μL 無(wú)菌肉湯，36 ℃培養(yǎng)18 h。用質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌(ATCC29213)同法操作驗(yàn)證藥敏檢測(cè)板的質(zhì)量。

1.2.5 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的鑒定

1.2.5.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照吳博威[7]提供的引物擴(kuò)增mecA基因。引物由北京擎科生物科技有限公司湖南分公司合成，上游引物:5′-CACCTTGTCCGTAACCTGAA-3′；下游引物：5′-TGGCTCAGGTACTGCTATCC-3′；目的片段大小約為533 bp。

1.2.5.2 DNA提取及擴(kuò)增 將藥敏試驗(yàn)篩選出對(duì)頭孢西丁和苯唑西林均耐藥的菌株，按照Biospin 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA。PCR反應(yīng)體系25 μL：DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，T3 Super PCR Mix 22 μL。反應(yīng)程序如下：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸12 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離 從257份牛乳樣品中分離鑒定金黃色葡萄球菌39株，分離率為15.18%。

2.2 細(xì)菌鑒定結(jié)果

2.2.1 質(zhì)譜鑒定 用BTS標(biāo)準(zhǔn)品作為質(zhì)控樣品對(duì)質(zhì)譜儀進(jìn)行自動(dòng)校準(zhǔn)，將采集的待測(cè)樣品數(shù)據(jù)圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌株的數(shù)據(jù)圖譜比對(duì)，得到相似度數(shù)值，達(dá)到種水平可信值即可判定(判定分值大于2.0)。質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，分離到的39株菌株均為金黃色葡萄球菌，部分結(jié)果見表1。

2.2.2 生化鑒定確認(rèn)

2.2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 39株疑似菌株經(jīng)革蘭氏染色、鏡檢，全部為革蘭氏陽(yáng)性、呈葡萄狀排列的球菌(圖1)。

2.2.2.2 觸酶反應(yīng) 滴加0.3%過氧化氫溶液后立即產(chǎn)生氣泡者即為觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，39株疑似菌株觸酶反應(yīng)全部顯示為陽(yáng)性(圖2)。

2.2.2.3 細(xì)菌生化鑒定 VITEK 2 Compact鑒定儀根據(jù)所分析的細(xì)菌和Vitek 2 GP細(xì)菌鑒定卡43個(gè)生化反應(yīng)的數(shù)據(jù)和知識(shí)等方法鑒定細(xì)菌。良好匹配的生化反應(yīng)和每個(gè)微生物的獨(dú)特生化反應(yīng)，良好匹配的可能性百分比99%。生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離到的39株菌株均為金黃色葡萄球菌(可信限范圍均大于95%)，鑒定結(jié)果與微生物質(zhì)譜鑒定的結(jié)果完全一致(部分生化鑒定結(jié)果見表2)。

2.3 藥敏檢測(cè)結(jié)果 根據(jù)藥敏檢測(cè)板說(shuō)明書讀取各抗菌藥物MIC值，結(jié)合 CLSI 規(guī)定的MIC折點(diǎn)來(lái)判斷分離菌株是否耐藥。藥敏結(jié)果顯示，39株分離菌株對(duì)青霉素耐藥率最高，為82.05%，對(duì)紅霉素耐藥率為33.33%，對(duì)克林霉素、替米考星、慶大霉素、頭孢西丁耐藥率在20%～30%之間；對(duì)于苯唑西林、氟苯尼考耐藥率在10%～20%之間；對(duì)多西環(huán)素及萬(wàn)古霉素絕對(duì)敏感，耐藥率為0(圖3)。

表1 部分分離菌株質(zhì)譜鑒定結(jié)果Tab 1 Results of mass spectrometry identification of some isolated strains

圖1 革蘭氏染色鏡檢圖(1000×)Fig 1 Gram staining microscopic examination (1000×)

1 ：陽(yáng)性對(duì)照；2：陰性對(duì)照；3：分離菌株1：positive control; 2:negative control; 3:Isolated strains圖2 觸酶試驗(yàn)結(jié)果Fig 2 Results of thiase test

表2 部分分離菌株生化鑒定結(jié)果Tab 2 Biochemical identification results of some isolated strains

圖3 分離菌株對(duì)18種抗菌藥物耐藥率圖Fig 3 The drug resistance rate of isolated strains to 18 kinds of antibacterial drugs

按照抗菌藥物分類，39株分離菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類(青霉素、奧格門丁、苯唑西林)抗菌藥物耐藥率達(dá)82.05%；對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素、替米考星)抗菌藥物耐藥率達(dá)35.89%；對(duì)磺胺類(磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明)及喹諾酮類(恩諾沙星、氧氟沙星)藥物耐藥率均為7.69%，詳見圖4。

圖4 分離菌株對(duì)不同類別抗菌藥物的耐藥率比較圖Fig 4 Comparison of drug resistamce rates isolates to different kinds of antibiotics

多重耐藥情況復(fù)雜，耐藥譜廣。發(fā)現(xiàn)有35株分離菌株表現(xiàn)為不同程度的耐藥，有17種不同的耐藥譜(表3)。最常見的耐藥譜為PEN，有15株，占菌株總數(shù)的41.03%。多重耐藥(三重耐藥及以上)菌株比例達(dá)38.46%，最多為9重耐藥，其中以7重耐藥菌株數(shù)最多，耐藥譜為PEN-CFX-CLI-ERY-OXA-TIL-GEN，占7.69%；多重耐藥主要集中在7～8重和3～4重耐藥。4株分離菌株對(duì)全部18種抗菌藥物均不耐藥。

2.4 MRSA的鑒定情況 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果在533 bp有條帶，即為檢測(cè)出mecA基因，判定為MRSA。39株分離菌株中有19株mecA基因檢測(cè)為陽(yáng)性，判定為MRSA(圖5)，MRSA檢出率為48.72%；

1～5.部分分離菌株mecA基因條帶；6.陰性對(duì)照；M.Maerker1～5.Parts of strains mecA gene bands;6.Negative control;M.Maerker圖5 mecA基因檢測(cè)電泳圖Fig 5 Electrophoretogram of identification of mecA gene

表3 分離菌株耐藥譜統(tǒng)計(jì)表Tab 3 Statistical table of drug resistance spectrum of isolated strains

結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)苯唑西林耐藥的7株菌株中有4株檢出mecA基因，即為OR-MRSA菌株，另15株則為OS-MRSA菌株。

3 討 論

本試驗(yàn)中細(xì)菌鑒定先用質(zhì)譜儀初步鑒定，再用全自動(dòng)生化鑒定儀進(jìn)行確認(rèn)。質(zhì)譜鑒定是基于微生物特征蛋白指紋圖譜進(jìn)行鑒定，而全自動(dòng)生化鑒定儀則是利用鑒別性的生化試驗(yàn)鑒定細(xì)菌的典型反應(yīng)。二者鑒別原理不同，本試驗(yàn)用兩種不同的鑒定方法是為了提高細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確率。

根據(jù)藥敏檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，湖南地區(qū)奶牛源金黃色葡萄球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥率達(dá)82.05%，且全部對(duì)青霉素耐藥；對(duì)紅霉素耐藥率為33.33%，這與寧夏地區(qū)[8]相關(guān)研究結(jié)果基本一致，但與我國(guó)其他奶牛養(yǎng)殖省份相關(guān)研究結(jié)果存在差異[9-12],尤其是對(duì)紅霉素、磺胺類、四環(huán)素類藥物耐藥率相差較大。總的來(lái)說(shuō)，近年來(lái)我國(guó)奶牛源金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素、紅霉素耐藥率普遍較高，且不同省份之間或是同一個(gè)省份不同地區(qū)耐藥性差異顯著，說(shuō)明金黃色葡萄球菌耐藥性具有地域性[13]，可能與各養(yǎng)殖場(chǎng)本身的用藥習(xí)慣有關(guān)。尤其是在湖南地區(qū)，養(yǎng)殖場(chǎng)用藥以青霉素為主，獲得性耐藥比例高。

本次分離的39株菌株中有4株對(duì)檢測(cè)的所有抗菌藥物不表現(xiàn)耐藥，推測(cè)可能是養(yǎng)殖場(chǎng)減抗或替抗成效明顯，亦或是耐藥基因表達(dá)沉默的結(jié)果[14]，需結(jié)合其他耐藥基因檢出情況進(jìn)行判斷。

一直以來(lái)，苯唑西林和頭孢西丁耐藥表型檢測(cè)被認(rèn)為是判斷MRSA的標(biāo)準(zhǔn)，然而近些年來(lái)，隨著養(yǎng)殖行業(yè)抗菌藥物使用種類和方式的改變，動(dòng)物源性細(xì)菌對(duì)于抗菌藥物的敏感性也在發(fā)生變化，已有部分MRSA 菌株表現(xiàn)對(duì)苯唑西林敏感[15]，即OS-MRSA。OS-MRSA的存在可能造成對(duì)MRSA的誤判，從而在抗菌藥選擇中引發(fā)超耐藥 MRSA 變異菌株的出現(xiàn)[16]；本次研究中，OS-MRSA的比例占全部MRSA的78.95%，說(shuō)明我省奶牛源MRSA對(duì)苯唑西林表現(xiàn)敏感的比例較高，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)我省奶牛源性O(shè)S-MRSA的監(jiān)測(cè)。另外，有3株分離株表現(xiàn)為對(duì)苯唑西林耐藥，卻未檢測(cè)到mecA基因，推測(cè)可能是藥敏試驗(yàn)讀數(shù)存在誤判，或與femB基因的協(xié)同作用有關(guān)[17]，需對(duì)femB基因進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。

通過對(duì)2020-2021年奶牛源金黃色葡萄球菌耐藥性監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)有近90%分離菌株表現(xiàn)為不同程度的耐藥，為避免多重耐藥菌株的出現(xiàn)，應(yīng)規(guī)范奶牛養(yǎng)殖業(yè)中抗菌藥的使用，在合理劑量范圍內(nèi)盡量選用敏感性高的藥物且輪換使用藥物，并且積極開發(fā)、使用抗菌藥替代品，如中草藥、噬菌體和抗菌肽等。此外，加強(qiáng)奶牛的飼養(yǎng)管理，做好養(yǎng)殖欄舍的清潔與消毒工作，規(guī)范擠奶操作也是預(yù)防奶牛乳房炎的重要舉措。