一種雞抗豬丁型冠狀病毒陽性血清的制備方法

李晶梅，張飛雁，王煥君，柏 嬌，于義娟，王碧群，朱 薇，鄭良益，李婷婷，馮 釗，石寶蘭，漆世華，謝紅玲

(國藥集團動物保健股份有限公司，武漢 430075)

陽性血清是免疫學方法鑒定病原體的重要生物材料，可應用陽性血清建立中和實驗、瓊擴、血凝、ELISA、膠體金等方法鑒定病原體并診斷疫病[1]。陽性血清還是獸用生物制品質量控制所需的重要生物材料。用陽性血清中和毒種、活疫苗中的活病毒，再接種生物組織，從而對毒種、活疫苗做鑒別檢驗和外源病毒檢驗，監控疫苗產品質量。豬病種類多，僅病毒病就包括豬瘟、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥、豬偽狂犬、豬圓環、豬口蹄疫、豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉等，針對不同疫病需制備相應的陽性血清用于疫苗質量控制。

雖然科研人員常用豬[2-4]、羊[5-6]、兔[7-9]制備豬病陽性血清，但趙華娥用雞制備豬流感陽性血清也獲得了成功[10]，并且用雞制備雞病陽性血清[11-13]有諸多成功經驗可供借鑒。本研究嘗試用SPF雞制備豬丁型冠狀病毒(PDCoV)陽性血清，為雞制備豬病陽性血清積累經驗。

1 材料和方法

1.1 毒種、細胞 豬丁型冠狀病毒(PDCoV)、PK1細胞，由國藥集團動物保健股份有限公司保存。

1.2 實驗動物 3～4周齡SPF雞，購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.3 主要試劑 DMEM培養基、胎牛血清，為BI公司產品；胰液素(3.75 mg/mL)、BEA、FITC標記的兔抗雞抗體，為SIGMA公司產品；胰酶，為Solarbio 公司產品；注射用白油，為道達爾公司產品；司本-80，吐溫-80，購自上海浩鼎貿易有限公司。

1.4 疫苗制備

1.4.1 PDCoV抗原制備 用細胞生長液(DMEM培養基+7%胎牛血清+終濃度100單位雙抗)將PK1細胞培養至單層。換病毒維持液(DMEM培養基+終濃度10 μg/mL胰酶、1%胰液素、100單位雙抗)，接種PDCoV，當出現80%細胞病變時，收集細胞培養上清，超濾濃縮至原體積的1/10，加入終濃度5 mmol/L的二乙烯亞胺(BEI，BEA加NaOH環化獲得)37 ℃滅活24 h，無菌檢驗、滅活檢驗合格后備用。

1.4.2 水相制備 取PDCoV抗原96份，向其中加入滅菌吐溫-80 4份，充分攪拌，直到吐溫-80完全溶解。

1.4.3 油相制備 取注射用白油94份，向其中加司本-80 6份，加熱、攪拌至混合均勻，高壓滅菌。

1.4.4 疫苗制備 水相與油相1∶2混合，在剪切機中以10000 r/min乳化10 min，制備成油包水型疫苗。

1.4.5 檢驗 參考《中華人民共和國獸藥典》2020年版三部附錄[14]方法對疫苗的外觀、劑型、黏度、穩定性、純凈性(無菌)進行檢驗，檢驗合格備用。

1.5 免疫、采血 疫苗免疫3～4周齡SPF雞10只，0.5 mL/只。每間隔2周或適當時長加強免疫一次，劑量同首次免疫。頸背部皮下、胸部肌肉、腿部肌肉交替接種疫苗。收集免疫前的雞血清，一免、二免、三免…后14 d或適當時長的每只雞的血清，作為被檢血清。

1.6 檢測 按1.7項方法分別檢測被檢血清中和效價，計算雞血清中和抗體的幾何平均值。選擇中和效價較高的血清混合，作為陽性血清；免疫前的雞血清混合，作為陰性血清。按1.8項的IFA方法將血清用于檢測PDCoV；檢測陽性血清對豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉中和效價；IFA方法檢測陽性血清與豬瘟、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥、豬偽狂犬、豬圓環、豬細小、豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉是否存在特異性結合。

1.7 中和效價測定 參考《中華人民共和國獸藥典》2020年版三部中和試驗法[14]建立如下PDCoV中和效價測定方法。

1.7.1 準備中和用病毒 將PDCoV用病毒維持液稀釋至100 TCID50/0.1 mL。

1.7.2 準備被檢樣品 用DMEM培養基將陰性血清、被檢血清4倍系列稀釋。將適宜稀釋度的血清分別與1.7.1項100 TCID50/0.1 mL 的PDCoV等體積混合，37 ℃中和1 h。

1.7.3 稀釋中和用病毒 將1.7.1項PDCoV用維持液做10倍系列稀釋，即100、10-1、10-2、10-3稀釋待用。

1.7.4 測定 96孔板中長成單層的PK1細胞，棄去細胞生長液。各孔加入0.1 mL DMEM培養基，棄去。1.7.2項各稀釋度被檢樣品接種PK1細胞，每個稀釋度接種6孔，0.2 mL/孔；1.7.3項各稀釋度的中和用病毒接種PK1細胞，每個稀釋度接種6孔，0.1 mL/孔；同時設置正常PK1細胞對照6孔，加入維持液，0.1 mL/孔。37 ℃、5% CO2培養箱孵育1 h，棄去孔內溶液，加入維持液0.1 mL/孔。37 ℃、5% CO2培養箱培養3 d判定結果。

1.7.5 判定結果 中和用病毒為30～300 TCID50/0.1 mL，正常細胞對照健活，試驗成立。記錄各稀釋度無細胞病變孔數，按Reed-Muench法計算其半數保護量(PD50)，計算各時間點PD50的幾何平均數，PD50幾何平均數的對數為平均中和效價。

1.8 IFA檢測PDCoV

1.8.1 準備細胞 96孔板中長成單層的PK1細胞，棄去細胞生長液。各孔加入0.1 mL DMEM培養基，棄去。

1.8.2 接毒 將PDCoV用病毒維持液稀釋至50 TCID50/0.1 mL，接種1.8.1的細胞，0.1 mL/孔。同時設置正常PK1細胞對照，加入維持液，0.1 mL/孔。37 ℃、5% CO2培養箱孵育1 h，棄去孔內溶液，加入維持液0.1 mL/孔。37 ℃、5% CO2培養箱培養3 d用于IFA檢測。

1.8.3 IFA檢測 陰性、陽性血清用PBS做10倍系列稀釋，陰性血清10-1、10-2，陽性血清10-2、10-3、10-4、10-5稀釋待用。1.8.2項中培養3 d的96孔板，80%丙酮固定，PDCoV感染孔、正常PK1細胞孔分別加入稀釋的陰性、陽性血清，0.1 mL/孔，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，加FITC標記的兔抗雞抗體，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，熒光顯微鏡下用藍色激發光(波長490 nm)觀察。有完整的細胞形態并發出特異性綠色熒光的視為IFA陽性孔。

2 結果與分析

2.1 抗原制備及檢測 用PK1細胞擴繁PDCoV抗原約1 L，經測定其病毒含量為108.3TCID50/mL。將PDCoV抗原超濾濃縮至100 mL，加入0.2 mol/L的BEI 2.5 mL，37 ℃滅活24 h，加入1 mol/L的Na2S2O3溶液0.5 mL中和BEI。將滅活后的抗原接種PK1細胞并盲傳1代，未見細胞病變，判定抗原滅活完全；將滅活后的抗原做無菌檢驗，各培養基均無菌生長，說明超濾濃縮可保證無菌。

2.2 疫苗制備及檢驗 100 mL水相與200 mL油相混合，乳化后獲得300 mL疫苗。疫苗外觀為乳白色乳劑、劑型為油包水型、粘度為65.8 cP、穩定性為10 mL疫苗經3000 r/min離心15 min未見分層且管底無水相；將疫苗做無菌檢驗，各培養基均無菌生長。說明疫苗質量合格，可用于免疫實驗雞。

2.3 免疫、采血 結合中和效價檢測結果確定免疫時間、免疫次數、采血時間，實際免疫程序見表1。每次免疫后14 d采血，四免后35 d、四免后52 d、五免后44 d采血。

表1 免疫程序Tab 1 Immunization procedure

2.4 血清中和效價 表2結果顯示，免疫前血清(陰性血清)有“中和效價”，平均為14.32，分析是因為血清中和了維持液中的胰酶、胰液素使PDCoV失去感染細胞的能力產生了“中和效價”。免疫前血清最高PD50為2.5 log4，說明PD50>2.5 log4的免疫后血清為特異性中和。血清中和效價隨免疫次數增加逐漸增高，四免14 d血清平均中和效價高于1000，五免后未見顯著增加。四免、五免14 d效價達到高峰后下降。

表2 血清中和效價Tab 2 neutralization titer of the sera

2.5 IFA檢測PDCoV 四免14 d效價為4.88 log4～5.16 log4的5份血清混合作為陽性血清用于IFA檢測PDCoV。陰性血清與PDCoV、PK1細胞有非特異性反應，10-1有淡綠色熒光(圖1A、B)，但10-2無可見熒光(圖1C、D)。PDCoV與PK1細胞用10-2、10-3、10-4稀釋的陽性血清檢測，PDCoV明顯比PK1細胞更亮(圖1E、F、G、I、J、K)，PDCoV是特異性熒光，判為陽性孔；PDCoV與PK1細胞用10-5稀釋的陽性血清檢測，均無特異性熒光(圖1H、L)。鑒于10-3陽性血清檢測PDCoV可見明亮的特異性綠色熒光并完整展現細胞形態，將其定為本批血清IFA檢測PDCoV的最適稀釋度。

A、B：PDCoV、PK1細胞，陰性血清10-1稀釋；C、D：PDCoV、PK1細胞，陰性血清10-2稀釋；E～H：PDCoV，陽性血清10-2～10-5稀釋；I～L：PK1細胞，陽性血清10-2～10-5稀釋A/B:PDCoV/PK1 cells,10-1diluted negative serum;C/D:PDCoV/PK1 cells,10-2diluted negative serum;E～H:PDCoV,10-2～10-5diluted positive serum;I～L:PK1 cells,10-2～10-5diluted positive serum圖1 IFA檢測PDCoV(100×)Fig 1 Detection of PDCoV infection by IFA(100×)

2.6 特異性檢驗 PDCoV陽性血清對豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉中和效價，均低于最低檢測值(<1∶16)。IFA檢測，PDCoV陽性血清對豬瘟病毒(CSFV)感染的ST細胞、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒(PRRSV)感染的Marc145細胞、豬偽狂犬病毒(PRV)感染的ST細胞、豬圓環病毒2型(PCV2)感染的PK15細胞、豬細小病毒(PPV)感染的IBRS-2細胞、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)感染的ST細胞、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)感染的Vero細胞無特異性反應(圖2)。

3 討論與結論

3.1 PDCoV陽性血清的應用 PDCoV感染可引起仔豬嘔吐、腹瀉等癥狀[15-16]，嚴重影響豬群的生長發育。PDCoV陽性血清可在ELISA、IHC、IFA等檢測方法中應用[17-19]，從而建立豬丁型冠狀病毒病的診斷方法。

A：CSFV-CSFV單抗；B：CSFV-PDCoV陽性血清；C：PRRSV-PRRSV單抗；D：PRRSV-PDCoV陽性血清；E：PRV-PRV單抗；F：PRV-PDCoV陽性血清；G：PCV2-PCV2單抗；H：PCV2-PDCoV陽性血清；I：PPV-PPV單抗；J：PPV-PDCoV陽性血清；K：TGEV-TGEV單抗；L：TGEV-PDCoV陽性血清；M：PEDV-PEDV單抗；N：PEDV-PDCoV陽性血清A:CSFV- McAb of CSFV;B:CSFV- positive serum of PDCoV;C:PRRSV- McAb of PRRSV；D:PRRSV- positive serum of PDCoV;E:PRV- McAb of PRV；F:PRV- positive serum of PDCoV;G:PCV2- McAb of PCV2；H:PCV2- positive serum of PDCoV;I:PPV- McAb of PPV；J:PPV- positive serum of PDCoV;K:TGEV- McAb of TGEV;L:TGEV- positive serum of PDCoV;M:PEDV- McAb of PEDV;N:PEDV- positive serum of PDCoV圖2 IFA檢測PDCoV陽性血清的特異性(100×)Fig 2 Specificity of PDCoV positive serum detected by IFA(100×)

陽性血清還可用于毒種和活疫苗的鑒別檢驗、純凈性檢驗，從而進行疫苗的質量控制。PDCoV在無胰酶、胰液素時，在ST、Vero、PK15等細胞上不產生細胞病變[20-21]，根據2020版獸藥典，具有此特性的PDCoV毒種做外源病毒檢驗可不進行中和，但仍需制備陽性血清用于毒種鑒別檢驗[14]。

3.2 用雞制備豬病陽性血清的優勢和可行性 ①用豬制備豬病陽性血清，需篩選抗原、抗體陰性豬，雞不感染豬病毒病，血清中不含各種豬病的抗體，還有供應充足、來源穩定的商品化SPF雞可用；②雞屬于小型實驗動物，飼養于隔離器中便于控制疫病感染，飼養管理比豬、羊更有優勢；③礦物油佐劑制備的油包水型疫苗免疫動物后產生比其他佐劑疫苗更高的抗體[22-24]，但哺乳動物對礦物油副反應大[22，25-26]，雞可耐受礦物油佐劑，可使用油包水型疫苗免疫[14]，從而獲得高效價抗體。

3.3 技術經驗總結分析 BEI屬于烷化劑類滅活劑，這類滅活劑能破壞病毒核酸芯髓，使病毒完全喪失感染力，而又不損害其蛋白衣殼、保留其保護性抗原[27]，因而比甲醛滅活制備的疫苗免疫原性更好，抗體效價更高。所以免疫用的PDCoV疫苗的抗原使用了BEI滅活。

PDCoV抗體效價在4次免疫后達到高峰，隨后下降較快，加免后效價再次達到高峰。分析原因，可能是雞非PDCoV的自然宿主，不能快速產生特異性抗體且效價下降較快。

3.4 成果及展望 本研究用SPF雞制備出PDCoV陽性血清，最高平均中和效價大于1000。1000倍稀釋的陽性血清用于IFA檢測PDCoV，感染PDCoV的細胞熒光顯微鏡下顯示特異性亮綠色熒光。陽性血清不與PDCoV外的主要豬病病原體反應，特異性良好。所以，制備的PDCoV陽性血清可用于中和法、IFA鑒別檢驗PDCoV，為疫苗研發奠定基礎。本研究為制備方法的前期研究，陽性血清保存條件、保存期等尚需深入研究。

豬病疫苗是生物制品企業的主要產品，企業對各種豬病陽性血清均有需求。豬病陽性血清屬于標準品，與疫苗、診斷制品相比，其用量少、經濟價值低，暫無穩定、批量供應各類豬病陽性血清的生產企業。如需使用，多為生物制品企業自行制備，或研究機構少量提供。所以，如能建立通用、簡易、可操作性強、質量穩定的豬病陽性血清制備方法，將降低豬用疫苗生產企業質控成本、提高質控質量。用雞制備PDCoV陽性血清方法成立，用雞制備其他豬病的陽性血清也有成功的可能，可對不同疫病做針對性、細致研究，以期將雞應用于更多豬病血清的制備。