雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)抗體間接ELISA檢測方法的建立

黃小潔，吳華偉，張 兵，楊承槐，孔冬妮，侯力丹，楊 飛，薛 麒*，劉 丹*

(1.中國獸醫藥品監察所，北京100081;2.中牧實業股份有限公司，農業部獸用生物制品與化藥重點實驗室，北京市獸用多肽疫苗設計與制備工程技術中心，北京100095)

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的雞和火雞的急性、高度接觸性傳染病[1],IBDV屬雙RNA病毒科雙RNA病毒屬。該病與禽網狀內皮組織增生癥、禽白血病、雞傳染性貧血病并稱為危害雞免疫系統的四大病毒性疾病[2]。該病主要感染3周齡以內的雞,雞群被感染后會造成中樞免疫器官法氏囊的損傷，從而引起免疫抑制，進而引起疫苗免疫失敗或繼發其他病毒性、細菌性疾病，嚴重的可以導致雞群大量死亡，給養禽業帶來巨大的經濟損失[3]。自從IBDV發現至今，雞傳染性法氏囊病目前幾乎遍及世界上所有養雞國家和地區，已成為危害養雞業的重要疾病之一。

目前防控IBDV最有效的方法就是疫苗免疫，但由于IBDV基因組易發生基因突變，不同毒株交叉感染還易發生基因組重配，造成疫苗免疫失敗[4]。因此，在使用IBDV疫苗免疫后，對雞群免疫后的保護性抗體水平進行評價，也是當前IBD防控工作中的重要課題。IBDV抗體的檢測方法主要有中和試驗、瓊脂擴散試驗(AGP)、間接免疫熒光試驗(IFA)及酶聯免疫吸附試驗(ELISA)[5]。中和試驗是評價雞群抗體的金標準，但操作繁瑣，耗時長，且需要用細胞培養，普通養殖場很難開展操作。瓊脂擴散試驗操作簡單，但耗時較長，不符合快速檢測的要求。IFA操作繁瑣，需要用細胞培養，且觀察需要用的熒光顯微鏡，既不方便也價格昂貴。而ELISA檢測方法具有特異性好、操作簡便、快速的優點，逐漸成為近年來研究的熱點。

本研究選用大腸桿菌表達系統表達IBDV的VP2蛋白作為包被抗原[6]，建立了檢測IBDV抗體的間接ELISA方法，為IBDV流行病學調查和隱性感染監測提供有效的監測手段，為試劑盒的研制提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 IBDV標準陽性血清及陰性血清、雞減蛋綜合征病毒(EDSV)陽性血清、雞新城疫病毒(NDV)陽性血清、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)陽性血清、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)陽性血清、禽網狀內皮組織增生癥病毒(REV)陽性血清和馬立克氏病火雞皰疹病毒(HVT)陽性血清、雞大腸桿菌陽性血清購自中國獸醫藥品監察所；禽流感病毒(AIV，H5、H9)陽性血清購自哈爾濱獸醫研究所；375份臨床血清采自SPF雞；HRP標記的Donkey anti-chicken IgY購自康為世紀生物科技有限公司；TMB由Sigma公司提供；酶標板為Corning公司產品；IBD ELISA抗體檢測試劑盒為IDEXX公司產品。

1.1.2 IBDV VP2蛋白的制備 參照文獻[6]，利用大腸桿菌表達系統進行VP2蛋白表達，純化后的蛋白濃度為800 μg/mL，將純化后的蛋白定量后作為ELISA包被用抗原。

1.2 方法

1.2.1 抗原包被濃度和待檢血清稀釋度的確定 用PBS將純化后蛋白進行倍比稀釋，取8、4、2、1、0.5 μg/mL 5個濃度，100 μL/孔包被酶標板，37 ℃ 1 h后 4 ℃過夜。洗滌后加入10%脫脂乳，每孔200 μL，37 ℃封閉1 h。洗滌拍干后分別加入1∶100、1∶200、1∶400、1∶800稀釋的 IBD 陽性血清和陰性血清進行ELISA方陣試驗，100 μL/孔，37 ℃ 1 h，洗滌后加入1∶1800稀釋的酶標抗體，100 μL/孔，37 ℃ 1 h；洗滌后加入TMB 底物溶液，100 μL/孔，37 ℃ 10 min，50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應。在酶標儀上測定OD450nm值，每個稀釋度做2個重復，取其平均值。以陽性血清的OD450nm值接近1.0、P/N值最大的所在孔的抗原濃度和血清稀釋倍數作為最佳抗原工作濃度和血清稀釋度。

1.2.2 酶標抗體稀釋度的確定 固定抗原包被濃度和待檢血清稀釋度，將HRP標記的驢抗雞酶標抗體稀釋為1∶10000、1∶12000、1∶15000、1∶18000、1∶20000，按照ELISA程序進行檢測，篩選酶標抗體的最佳稀釋度。

1.2.3 封閉液的確定 以1% BSA、10%脫脂乳、10%馬血清、3%明膠，1% OVA封閉包被板，用IBDV標準陰性、陽性血清進行檢測，以確定最佳包被液。

1.2.4 最佳包被條件的確定 分別選擇4 ℃過夜、37 ℃ 1 h+4 ℃過夜、37 ℃ 2 h三個反應條件進行檢測，以確定最佳包被條件。

1.2.5 抗原稀釋液的確定 分別用0.01 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)和0.01 mol/L PBS(pH7.2)稀釋VP2蛋白進行檢測，確定抗原稀釋液。

1.2.6 ELISA反應時間的優化

1.2.6.1 待檢血清反應時間的確定 加入最佳稀釋度的IBDV標準陽性血清和陰性血清，按作用時間分別為37 ℃ 30 min、37 ℃ 60 min、37 ℃ 90 min及37 ℃ 120 min進行ELISA檢測，確定血清最佳反應時間。

1.2.6.2 酶標抗體作用時間的確定 加入酶標抗體后，分別按37 ℃ 30 min、37 ℃ 60 min、37 ℃ 90 min及37 ℃ 120 min進行ELISA檢測，確定酶標抗體最佳反應時間。

1.2.6.3 底物反應時間的確定 加入底物后，按室溫10、15、20 min進行反應，以P/N值最高確定最終反應時間。

1.2.7 陰陽性臨界值的確定 按照已建立的IBDV抗體間接ELISA方法進行檢測。通過對375份陰性雞血清樣品進行檢測，根據檢測結果計算陰性血清的OD450nm平均值和標準差，將平均值+3×標準差作為判斷陰陽性血清臨界值的標準。

1.2.8 特異性試驗 用已建立的IBDV抗體間接ELISA檢測方法對抗EDSV、NDV、IBV、ILTV、REV、ALV(H5)、ALV(H9)和HVT等8種禽常見傳染病病毒陽性血清和雞大腸桿菌陽性血清進行測定，評價該IBDV抗體間接ELISA檢測方法的特異性。

1.2.9 敏感性試驗 取4份IBDV陽性血清，分別進行1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200稀釋后進行檢測，同時與IDEXX公司生產的IBDV抗體檢測試劑盒進行比較，以評價IBDV抗體間接ELISA檢測方法的敏感性。

1.2.10 重復性試驗

1.2.10.1 批內重復性試驗 取同一批次三塊ELISA板，對4份陽性血清、4份陰性血清進行ELISA測定，每個平行做3孔，進行批內重復性試驗，檢測結果進行統計學分析、計算變異系數。

1.2.10.2 批間重復性試驗 不同時間制備的三批抗原包被的ELISA板，對4份陽性血清、4份陰性血清進行ELISA測定，每個平行做3孔，進行批間重復性試驗，檢測結果進行統計學分析、計算變異系數。

1.2.11 與IDEXX公司的IBDV抗體檢測試劑盒進行符合率比較 用已建立的IBDV抗體間接ELISA檢測方法檢測不同抗體效價的血清184份，同時將這些血清按照IDEXX公司的IBDV抗體檢測試劑盒說明進行測定。根據結果確定兩者之間的符合率。

2 結果與分析

2.1 抗原包被濃度和待檢血清稀釋度的確定 ELISA方陣試驗結果表明，在抗原的包被濃度為8 μg/mL，每孔100 μL，待檢血清稀釋度為1∶400時，陽性血清OD450nm在1.0左右，且P/N值最大(表1)。

表1 抗原包被濃度和待檢血清稀釋度的確定Tab 1 Determination of antigen concentration and serum dilution

2.2 酶標抗體稀釋度的確定 在最適抗原包被濃度和待檢血清最佳稀釋度條件下，將HRP標記的驢抗雞酶標抗體稀釋為1∶10000、1∶12000、1∶15000、1∶18000、1∶20000，按照ELISA程序檢測，結果表明酶標抗體的最佳稀釋度為1∶15000(表2)。

表2 不同酶標抗體稀釋度的ELISA結果Tab 2 ELISA results of dilution of different enzyme-labeled antibodies

2.3 封閉液的確定 分別以1%BSA、10%脫脂乳、10%馬血清、3%明膠、1% OVA封閉包被板，用IBDV標準陰性、陽性血清進行檢測，結果顯示10%馬血清的封閉效果最好(表3)。

表3 不同封閉液條件的ELISA結果Tab 3 ELISA results of different sealing fluid

2.4 最佳包被條件的確定 分別選擇4 ℃過夜、37 ℃ 1 h+4 ℃過夜、37 ℃ 2 h三個反應條件進行檢測，結果顯示4 ℃過夜、37 ℃ 1 h+4 ℃過夜效果較好，確定最佳包被條件為4 ℃過夜(表4)。

表4 不同包被條件的ELISA結果Tab 4 ELISA results of different coating conditions

2.5 抗原稀釋液的確定 分別用0.01 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)和0.01 mol/L PBS(pH7.2)稀釋VP2蛋白進行檢測，兩者差異不大，選擇常用的0.01 mol/L PBS(pH7.2)作為抗原稀釋液(表5)。

表5 不同抗原稀釋液的ELISA結果Tab 5 ELISA results of different Antigen Diluents

2.6 待檢血清反應時間的確定 加入最佳稀釋度的IBDV標準陽性血清和陰性血清，按作用條件分別為37 ℃ 30 min、37 ℃ 60 min、37 ℃ 90 min及37 ℃ 120 min進行ELISA檢測，確定血清最佳反應時間為90 min(表6)。

表6 不同血清反應時間的ELISA結果Tab 6 ELISA results of different serum reaction time

2.7 酶標抗體作用時間的確定 加入酶標抗體后，分別按37 ℃ 30 min、37 ℃ 60 min、37 ℃ 90 min及37 ℃ 120 min進行ELISA檢測，確定酶標抗體最佳反應時間為37 ℃ 60 min(表7)。

表7 不同酶標抗體作用時間的ELISA結果Tab 7 ELISA results of different enzyme labeled antibody reaction time

2.8 底物反應時間的確定 加入底物后，按室溫10、15、20 min進行反應，確定最終反應時間為15 min(表8)。

表8 不同底物作用時間的ELISA結果Tab 8 ELISA results of different substrates reaction time

2.9 陰陽性臨界值的確定 按照已建立的IBDV抗體間接ELISA方法進行檢測。通過對370份陰性雞血清樣品進行檢測，計算得到陰性血清的OD450 nm平均值為0.144，標準差為0.048，臨界值=平均值+3×標準差=0.144+3×0.044=0.288(表9)。

2.10 特異性試驗 用已建立的IBDV抗體間接ELISA檢測方法對抗EDSV、NDV、IBV、ILTV、REV、ALV(H5)、ALV(H9)和HVT等8種禽常見傳染病病毒陽性血清和雞大腸桿菌陽性血清進行測定，檢測結果均為陰性，證明無血清交叉反應，建立的IBDV抗體間接ELISA檢測方法具有很好的特異性(表10)。

2.11 敏感性試驗 表11結果表明，本試驗建立的ELISA方法檢測1∶400至1∶1600倍稀釋的血清均為陽性，IDEXX公司生產的IBDV抗體檢測試劑盒檢測的最高限1∶1600為陽性，說明兩者的敏感性相當(表11)。

表11 ELISA方法敏感性試驗結果Tab 11 The results of the sensitivity of ELISA method

2.12 重復性試驗

2.12.1 批內重復性試驗 結果見表12，變異系數為3.3%～7.3%，小于10%，表明有很好的批內重復性。

2.12.2 批間重復性試驗 結果見表12，變異系數為1.9%～6.0%，小于10%，表明有很好的批間重復性。

表12 ELISA方法批內重復試驗和批間重復試驗結果Tab 12 The results of the repeated batch test and iner batch test

2.12.3 與IDEXX公司IBDV抗體檢測試劑盒進行符合率比較 結果見表13。建立的IBDV抗體間接ELISA檢測方法，檢測結果為陽性12份，陰性172份；IDEXX公司IBDV-ELISA抗體試劑盒的檢測結果為陽性14份陽性，陰性170份，符合率為95.7%。

表13 建立的間接ELISA方法與IDEXX-ELISA試劑盒檢測結果比較Tab 13 Comparision the results of the indirect ELISA method with the IDEXX-ELISA kit

3 討 論

目前，商品化的IBD抗體間接ELISA試劑盒采用的是全病毒包被酶標板，病毒的制備過程繁瑣，成本高，不利于推廣應用，而且全病毒包被，有較強的背景反應和非特異性反應，易造成實驗結果不準確。在IBDV的5個病毒蛋白中，VP2和VP3蛋白均可以用來研制IBDV的抗體檢測試劑盒，VP2是病毒的衣殼蛋白，也是病毒的主要保護性抗原，有研究表明用VP2蛋白來研制IBDV抗體檢測試劑盒比VP3具有更好的優勢[7-8]。雖然，IBD重組VP2蛋白可由多種表達系統進行表達[9-12]，但若要研制IBDV抗體檢測試劑盒，大腸桿菌表達系統是首選，表達量高，生產和純化方便。為此，試驗選用重組VP2蛋白作為包被抗原，并通過原核表達系統來制備，操作簡便，經濟，特異性高。

在對臨床樣品的檢測中，本方法跟IDEXX公司的試劑盒相比符合率很高，IDEXX試劑盒多檢出的兩份陽性樣品，用經典的瓊脂擴散試驗方法(參照《中國獸藥典》2020年版三部)進行復核，結果為陰性，與本方法檢測結果一致，說明本方法檢測準確率高。酶標液的選擇是影響ELISA試驗特異性的主要因素[13]。研究使用10%的馬血清做為封閉液封閉酶標板，大大降低了非特異性因素影響。包被抗原的濃度和陰陽性血清稀釋度是否適宜也影響ELISA試驗特異性和敏感性，試驗中陽性血清稀釋到1∶1600仍然能檢測出來，說明方法的敏感性非常好。抗原的包被濃度如果太高，蛋白分子間相互作用會造成分子的多層化，洗的時候這些蛋白容易被洗掉，造成試驗的非特異性；濃度太低，載體表面吸附的抗原量太少，容易出現假陰性的情況，造成結果的不準確。試驗將包被抗原稀釋為8 μg/mL，每孔加入100 μL，試驗的特異性最高。血清的稀釋度也直接影響試驗的特異性和靈敏度。試驗顯示，隨著血清稀釋度的增加，陽性樣品OD值有下降趨勢。而陰性樣品的OD值變化不大。可能是因為血清中蛋白成分復雜，有可能在ELISA反應體系會出現非特異性反應，因此對血清做適宜的稀釋可降低這種非特異性反應。該方法與其他血清不出現交叉反應，說明方法的特異性好。

本研究優化了間接ELISA方法的反應體系和反應條件，證明方法的敏感性高、特異性和重復性好，與國外同類型的商品化試劑盒的復合率高，初步建立了檢測IBDV抗體的間接ELISA方法，為商品化試劑盒的研制奠定了基礎。