以RAS固體廢棄物為碳源的改進型人工濕地對養殖尾水的脫氮效果

曹濤濤 徐 棟 白國梁 胡 澤 陳迪松 吳振斌

(1.中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2.中國科學院大學, 北京 100049; 3.武漢市生態環境科技中心, 武漢 430015; 4.中國地質大學環境學院, 武漢 430074)

人工濕地是模擬自然濕地系統設計和建造的污水處理系統, 旨在利用濕地中植物、填料及微生物的共同作用去除廢水中的氮磷等污染物[1]。因其具有成本低、環境友好等優點已被廣泛應用于養殖尾水的處理。在人工濕地中微生物的硝化反硝化作用對脫氮的貢獻最大, 且反硝化作用是其實現TN去除的主要微生物機制[2]。但是含有高濃度顆粒物的廢水直接進入人工濕地易造成人工濕地堵塞[3], 而且對于低碳高氮的污水, 碳源不足通常會限制其整體脫氮效果[4]。目前, 人工濕地碳源補充方式有: (1)投加甲醇、葡萄糖和乙酸鈉等, 可以顯著提高人工濕地的脫氮性能, 但也存在著碳源的沖擊負荷大易引起二次污染及成本高昂的缺點[5—7];(2)農業固體廢棄物如玉米芯、稻殼、稻草和木屑等, 具有來源廣泛、成本低廉、緩慢釋放的特點,但是也會產生二次污染的問題, 還可能引起濕地堵塞[8]; (3)人工合成的可降解聚合物如聚乳酸等, 具有穩定釋放的特點, 但成本也相對較高[9]。

循環水養殖系統(Recirculating Aquaculture System, RAS)為了滿足養殖產品的生長需求, 通常保持較高的DO和較強的硝化作用, 長期運行會有硝酸鹽的大量積累[10]。養殖期間還會產生大量由殘餌、糞便等構成的固體廢棄物, 糞便和殘餌中通常含有大量未利用有機物和氮磷營養物質[11]。高氮低碳的養殖尾水和高營養的養殖固體廢棄物如果不能妥善處理, 將對環境產生不利影響。已有研究嘗試將殘餌和糞便等固體廢棄物經過發酵或水解的產物用作反硝化的補充碳源[12], 但是固體廢棄物經過發酵或水解的產物中除了有機碳源外, 還含有大量的氮磷污染物, 提高了處理難度[13]。

本研究構建了一種改進型人工濕地, 通過在濕地下部營造局部厭氧環境, 促使水產養殖固體廢棄物釋放可利用的溶解性碳源, 在防止垂直潛流濕地堵塞的同時實現反硝化脫氮, 以期為人工濕地處理循環水養殖系統廢物的工程實踐提供理論指導。并利用高通量測序的方法, 對人工濕地微生物群落結構及脫氮功能微生物進行了分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

養殖固體廢棄物收集自某養殖基地的循環水養殖系統。在實驗室對高含水率的養殖固體廢棄物進行混勻分裝, -20℃冷凍保存。并對其組成進行了分析, 其主要成分為TS(23.5±2.2) mg/L、VS(564.3±7.9) mg/g、COD(38.5±16.5) g/L、TN(44.1±4.4) mg/g、TOC(343.0±29.5) mg/g和TP(45.6±1.0) mg/g。此外, 循環水養殖系統水質參數為TN 17.49 mg/L,16.61 mg/L, DO 7.13 mg/L。

1.2 濕地裝置

為了在資源化利用養殖固體廢棄物的同時實現對低碳氮比的循環水養殖尾水的反硝化脫氮, 本研究對人工濕地結構及流程進行了改進。模擬濕地系統構造如圖1所示, 主要分為養殖固體廢物厭氧水解區(A區)和濕地填料區(B區)兩部分組成。A區位于濕地裝置下部, 內徑19 cm, 深度50 cm, 該區域填充數層低密度聚氨酯海綿作為微生物附著的基質, 同時防止顆粒物上浮進入濕地系統。B區位于厭氧水解區的上部, 內徑20 cm, 自下而上依次填充了礫石、陶粒和石英砂, 并在濕地表面種植了紅花美人蕉。本研究共構建5組設置了不同厭氧水解區深度的模擬人工濕地, CW1#(A區深度50 cm,容積14.5 L)、CW2#(A區深度30 cm, 容積9.3 L)、CW3#(A區深度15 cm, 容積4.7 L)、CW4#(A區深度0 cm)和CW5#(A區深度0 cm), 各組濕地裝置B 區容積均在9.5 L左右。

圖1 實驗裝置圖Fig.1 Schematic diagram of the experiment

1.3 裝置運行

首先, 向系統內投加高營養廢水, 并接種城市污水處理廠的厭氧污泥, 馴化運行1個月, 待模擬濕地系統運行穩定后開展實驗。實驗期間模擬濕地系統間歇運行, 5d一個周期。實驗系統進水為模擬尾水, 其水質指標:18.0—20.0 mg/L,2.0 mg/L,0.05 mg/L, COD 2.5 mg/L, TP 1.0 mg/L, 參考所調查的循環水養殖系統的水質配制。通過逐步提升養殖固廢棄物投加量, 逐步提高進水中C/N比, 以TCOD/TN計共分為3.09±0.90、5.33±0.39和8.78±0.41三個低、中、高C/N比階段。

模擬人工濕地系統采取潮汐流的運行方式, 在每個運行周期, 對于設置了厭氧水解區的CW1#、CW2#和CW3#號裝置, 首先通過蠕動泵將一定體積的模擬尾水泵入模擬人工濕地系統。然后將養殖固體廢物與一定體積的模擬尾水混合后其泵入A區, 保持兩次進水體積比為1∶1。在系統運行2d后, 將B區的水從濕地進出水口排入進水槽, 再泵入A區, 更換上下層水, 隨后反應器繼續運行3d。在一個周期結束后, 將反應器中的水從系統出水口排出。每運行5個周期, 對裝置進行完全排空一次。對于未設置厭氧水解區的CW4#和CW5#號裝置, 將模擬尾水和養殖固體廢棄物混合后直接從濕地進出水口泵入濕地, 且每個周期的進水負荷及其他運行條件與CW1#、CW2#和CW3#號裝置保持一致。模擬人工濕地系統自2021年6月19號開始, 在室溫下(＞20℃)馴化并運行共115d。

1.4 采樣分析

在每個周期開始時采集模擬尾水、養殖固體廢物與模擬尾水混合液, 結束時采集裝置出水。通過測定養殖固體廢物與模擬尾水混合液: 模擬尾水為1∶1的混合液得出系統整體的污染物濃度負荷。進出水中的、、、TN、TP和COD采用國家標準方法測定, TSS采用稱重法測定[14]。DO、水溫和pH用便攜式多參數水質分析儀(YSI Professional Plus美國)現場測定。在第90天,濕地運行的后期, 采集A區和B區的填料樣品, 用于微生物群落分析。對于裝置CW1#、CW2#和CW3#分別設點采集下層厭氧A區和上層濕地填料B區的基質樣品, 對于裝置CW4#和CW5#設點采集濕地填料區的基質樣品, 并置于無菌袋中, 在 4℃下保存運輸到實驗室, 隨后樣品放于-80℃冰箱保存待測。模擬人工濕地裝置CW1#、CW2#和CW3#下層厭氧A區樣品分別記為CW1#-L、CW2#-L和CW3#-L, 上層濕地填料B區樣品分別記為CW1#-U、CW2#-U和CW3#-U, 裝置CW4#和CW5#濕地填料區的基質樣品記為CW4#-U和CW5#-U。

1.5 DNA 提取、高通量測序及數據分析

模擬濕地系統基質樣品中的 DNA 使用TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒完提取[天根生化科技(北京)有限公司, DP812]。使用酶標儀(GeneCompang Limited, synergy HTX)對提取的核酸進行濃度檢測, 檢測合格后進行擴增, 并對擴增后PCR產物使用濃度1.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性(北京博美富鑫科技有限公司)。本研究選擇16S rDNA V3+V4 可變區片段進行PCR擴增, 引物序列為341F(5′-CCTACGGGNGGCWG CAG-3′)和805R(5′- GACTACHVGGGTATCTAA TCC-3′)。擴增后PCR產物經純化、定量和均一化形成測序文庫, 建好的文庫隨后用Qsep-400方法進行質檢, 最后由青島百邁客生物科技股份有限公司基于Illumina NovaSeq6000 (Novaseq6000, Illumina)平臺進行高通量測序。在相似性閾值為97%的情況下對過濾后的優化序列進行聚類劃分OTUs (可操作分類單元, Operational Taxonomic Units), 確定α-多樣性指數, 使用 Origin 2021繪制圖形, 利用R語言分析樣本間微生物豐度差異。

2 結果

2.1 模擬濕地系統進出中水各形態N濃度及去除效果

圖2顯示了模擬濕地系統進水和出水N濃度變化, 圖3顯示了模擬濕地系統對N的去除效果變化。由圖2a和圖2d可知, 隨著養殖固廢棄物投加量的增大, 即進水中C/N比的逐步提升, 濕地系統進水中TN和濃度也逐步提升, TN濃度從(20.06±1.58) mg/L上升到(29.78±1.59) mg/L,濃度從(3.21±0.09)上升到(4.71±0.53) mg/L。由圖2b和圖2c可知, 濕地系統進水中濃度保持在19.0 mg/L左右,濃度在0.047—0.085 mg/L, 表明進水中TN濃度的提升主要由氨氮和有機氮貢獻。

圖2和圖3結果表明, 各組實驗裝置在中低C/N階段, 均出現了積累的現象; 在低C/N階段, 還出現了養殖固體廢棄物釋放導致出水中濃度升高的現象; 在高C/N階段, 出水中各形態的N濃度均明顯下降,積累現象消失。在高C/N階段, 但各組裝置對TN和去除率分別為(80.72±11.16)%和(97.87±1.49)%; 對的去除率為(49.73±20.66)%, 對和去除效果仍有較大波動。總體而言, 對于5組實驗裝置, 隨著C/N的提升, 出水中TN、和濃度逐漸下降, 系統對TN、和的去除率不斷升高。

圖2 模擬濕地系統進出水中各形態N濃度Fig.2 Concentrations of various forms of N in the influent and effluent of the simulated CWs

圖3 模擬濕地系統對各形態N的去除率Fig.3 Removal rate of various forms of N in the effluent of the simulated CWs

由圖4可知, 對于5組實驗裝置, 在以養殖固體廢棄物為碳源時的中低C/N階段, 裝置CW1#、CW2#相比于CW3#、CW4#、CW5#, 出水中TN、和濃度均處于相對較低的水平; 進入到高C/N階段, 裝置CW1#、CW2#相比于CW3#、CW4#、CW5#, 出水中濃度也處于相對較低的水平。

圖4 濕地裝置構型對進出水N濃度變化影響Fig.4 Influence of simulated CWs configuration on N concentration in influent and effluent

2.2 微生物群落多樣性

本次實驗8個樣品測序共獲得954322條高質量序列, 聚類劃分后共產生706個OTUs (可操作分類單元, Operational Taxonomic Units)。模擬濕地系統A區和B區基質樣品的α-多樣性指數(Chao1、Shannon和Simpson多樣性指數及Coverage指數)如表1所示。基質樣品測序的樣本文庫覆蓋度(Coverage指數)均大于0.999, 表明測序對樣品覆蓋度較高, 能較好地反映樣本的真實情況。對于裝置CW1#、CW2#和CW3#, B區的Chao1、Simpson和Shannon多樣性指數分別在625.4—655.6、0.951—0.967和6.29—6.41, A區則分別為567.3—607.4、0.933—0.979和5.37—6.61, Chao1指數值越大說明物種數目越多, Shannon指數值越大、Simpson 指數值越小說明群落多樣性越高, 可見A區物種數目略低于B區, A區和B區總體的群落多樣性差異不明顯。

表1 模擬濕地系統細菌群落豐富度和多樣性分析Tab.1 Analysis of bacterial community abundance and diversity of simulated CWs

依據不同微生物樣品的屬水平組成, 對樣品進行偏最小二乘判別法(PLS-DA, Partial Least Squares Discriminant Analysis)分析, 結果如圖5所示。PLSDA通過尋找物種豐度矩陣和給定的樣品分布/分組信息的最大協方差, 從而在新的低維坐標系中對樣品重新排序, 坐標圖上距離越近的樣品, 相似性越大, 且可以減少變量間多重共線性產生的影響。從圖5可以看出, A區樣品CW1#-L、CW2#-L和CW3#-L更靠近且樣品CW1#-L和CW2#-L距離更近;B區樣品CW1#-U、CW2#-U和CW3#-U距離更靠近, CW4#-U和CW5#-U距離更靠近, 且設有厭氧水解區的裝置和未設有該區的裝置相比, 濕地填料區樣品離散程度較大, 表明厭氧水解區的設立以及濕地系統整體深度的增加會對其上層濕地填料區微生物組成產生影響。

圖5 微生物樣品PLS-DA分析Fig.5 PLS-DA analysis of microbial samples

2.3 門屬微生物群落組成

從圖6可以看出, 在門水平上, 各濕地系統優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria), 其在各裝置A區相對豐度在44.44%—62.87%, B區相對豐度在61.93%—78.64%; 豐度較高的還有綠彎菌門(Chloroflexi, 占比4.49%—23.45%)、擬桿菌門(Bacteroidetes, 占比3.69%—7.38%), 變形菌門(Proteobacteria)在裝置CW1#、CW2#、CW3#、CW4#和CW5#中的B區有較高的豐度, 綠彎菌門則在裝置CW1#、CW2#和CW3#的A區的豐度較高。髕骨細菌門(Patescibacteria)在裝置CW1#和CW2#中有較高的豐度, 且在A區的豐度高于B區; 浮霉菌門(Planctomycetes)在裝置CW1#A區有更高的豐度, 在裝置CW2#和CW3#A也有相對B區較高的豐度; 厚壁菌門(Firmicutes)在各裝置的B區有較高的豐度; 此外芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和酸桿菌門(Acidobacteria)在裝置CW2#和CW3#中相對豐度較高, 疣微菌門(Verrucomicrobia)在裝置CW4#和CW5#中相對豐度較高。

圖6 模擬濕地系統門水平細菌組成Fig.6 Bacterial composition at the phylum levels of simulated CWs

由圖7可知, 在屬水平上,Silanimonas、Rivibacter、uncultured_f_A4b、uncultured_f_Burkholderiaceae和Rubrivivax等豐度相對較高。本次實驗共發現40個氮代謝相關菌屬, 其中有37個反硝化菌屬,1個硝化菌屬和 1 個未培養的厭氧氨氧化菌屬, 表2列舉了相對豐度相對較高的部分。對于各裝置, 反硝化菌屬豐度較高的為Silanimonas、Rivibacter、紅桿菌屬(Rhodobacter)。

表2 脫氮功能微生物菌群分析Tab.2 Analysis of microorganisms with denitrification function

圖7 模擬濕地系統屬水平細菌組成Fig.7 Bacterial composition at the genus levels of simulated CWs

3 討論

3.1 養殖固體廢棄物投加對脫氮效果的影響

3.2 裝置構型對脫氮效果的影響

本研究發現厭氧水解區深度為30和50 cm的改進型人工濕地脫氮效果更好。有研究表明人工濕地具有復雜的微環境, 硝化、反硝化和厭氧氨氧化過程均可能存在, 能實現對各形態氮的去除[18]。厭氧氨氧化是在厭氧條件下, 微生物以作為電子受體將氧化成N2, 實現了對和較好的去除效果[19]。在本研究中, 進水中較高濃度的有機物分解耗氧, 在濕地下部較深的厭氧水解區處形成相對嚴格厭缺氧環境, 加之濕地長期運行的馴化效果, 有利于A區發生厭氧氨氧化過程,從而強化了改進型人工濕地的脫氮效果。

3.3 模擬濕地系統中的微生物組成差異

從微生物門組成上看, 本研究中變形菌門(Proteobacteria)在B區的相對豐度較高, 有研究認為其是反硝化細菌的主要來源[20]。也有研究表明, 變形菌豐度與環境養分狀況相關[21], 其對營養物質尤其是 N 的輸入反應較為敏銳[22], 與氮循環、生物固氮作用密切相關[23]。綠彎菌門(Chloroflexi)和髕骨細菌門(Patescibacteria)在裝置CW1#和CW2#的A區相對豐度較高, 二者通常參與厭氧發酵過程, 與有機物分解有關[24], 且髕骨細菌門(Patescibacteria)是在厭氧氨氧化反應器中經常觀察到異養細菌[25]。厭氧氨氧化細菌則是屬于浮霉菌門下浮霉菌門(Planctomycetes)的類群[26], 本研究中其在裝置CW1#下層A區有較高的豐度, 在裝置CW2#下層A區豐度也相對較高。

從微生物屬水平上看, 對于設有厭氧水解區且深度相對較大的裝置CW1#和CW2#, 反硝化菌屬在濕地系統中分布情況較為類似, 且在兩套裝置濕地下層A區均發現了豐度相對較高的具有厭氧氨氧化功能的未培養菌屬(uncultured_c_Anammox_3)和一種被認為有助于厭氧氨氧化過程的菌株SM1A02[27];裝置CW3#、CW4#和CW5#相比于裝置CW1#和CW2#, B區Silanimonas、Rivibacter和紅桿菌屬(Rhodobacter)的豐度更高。反硝化菌屬相對總豐度在裝置CW1#的B區和A區分別為45.05%和21.58%, 裝置CW2#的B區和A區分別為53.18%和24.81%, 裝置CW3#的B區和A區分別為46.26%和46.31%, 裝置CW4#的B區為60.55%, 裝置CW5#的B區為48.61%, 表明較小的厭氧水解區深度對反硝化菌豐度影響較小, 較大的厭氧水解區深度形成的厭氧條件會更嚴格, 厭氧區反硝化菌屬總豐度也會降低。總體而言, 模擬人工濕地中脫氮菌群以具反硝化功能的菌群為主。

4 結論

(1)養殖固體廢棄物的投加量增加會提升濕地進水中N負荷, 但隨著碳氮比的提升和厭氧區深度的增加, 濕地系統對N的去除效果提升, 當進水TCOD/TN為8.78±0.41時, 且厭氧區深度為30和50 cm時, 模擬濕地系統對TN、和的去除效果較好, 人工濕地具有在資源化利用養殖固體廢棄物的同時, 實現對循環水養殖系統氮負荷的削減的可能性。(2)模擬濕地系統中反硝化菌屬豐度較高, 主要為Silanimonas屬和Rivibacter屬, 且濕地填料B區反硝化菌屬相對豐度高于下層厭氧A區, A區還發現有未培養的厭氧氨氧化菌屬(uncultured_c_Anammox_3)分布。改進型人工濕地在以養殖固體廢棄物為碳源時, 主要通過反硝化作用脫氮, 且存在一定的厭氧氨氧化過程。