監測外周血中性粒細胞胞外誘捕網含量對食管癌遠處轉移的預測價值

林杰 錢佶 蔣國軍 陳明治

食管癌是我國常見的消化系統惡性腫瘤之一，發病率和病死率均居高不下［1-3］。轉移是食管癌高病死率的主要原因之一［4］。中性粒細胞和淋巴細胞是機體含量最多的先天性免疫細胞，與食管癌患者的臨床預后密切相關［5］。近年來的研究表明中性粒細胞胞外誘捕網（NET）在腫瘤的局部生長和遠處轉移過程中扮演了重要角色［6］。Zhang 等［7］的研究證實術前腫瘤中NET 含量的增加與食管癌患者的不良預后密切相關。但尚未見NET 生成與食管癌遠處轉移的研究報道，因此，本研究將檢測食管癌患者外周血中NET 含量，采用logistic 回歸分析和受試者操作特征（ROC）曲線評價NET 生成的相關指標對食管癌遠處轉移的預測價值，旨在為食管癌的防治提供新視角。

對象與方法

一、研究對象

前瞻性選取2020 年1 月至2021 年12 月在本院就診的60 例中晚期食管癌患者為研究對象，根據是否發生遠處轉移將其分為非遠處轉移組（35例）和遠處轉移組（25 例）。納入標準：①成年人（年齡 ≥18 周歲）；②經纖維胃鏡及病理組織學檢查確診食管癌。排除標準：①合并嚴重血液疾病；②合并其他惡性腫瘤；③合并感染；④合并嚴重的難以控制的糖尿病。匹配30 名同期在本院進行體檢的健康志愿者作為對照組。本研究獲得本院倫理委員會批準（意見號：倫申2022 文112）。所有入組者均對本研究知情同意，并簽署知情同意書。3 組的基本資料具可比性，見表1。

表1 2 組食管癌患者與健康志愿者基本資料比較

二、雙抗體夾心法檢測外周血中NET［髓過氧化物酶（MPO）-DNA］含量

采用EDTA 抗凝管采集患者外周靜脈血2 mL，在室溫條件下600×g 離心10 min，收集上清液，采用雙抗體夾心法檢測NET 含量。具體方法如下：將抗MPO 單克隆抗體（購自Merck Millipore Corp 公司）包被于96 孔培養板中，置于4℃冰箱孵育過夜。用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗洗滌3 次后加入5%牛血清白蛋白（BSA），室溫封閉2 h。用PBS 洗滌后加入上述上清液標本，室溫孵育2 h。再次洗滌3 次后加入辣根過氧化物酶偶聯的抗DNA 單克隆抗體（DNA-HRP， 購自Roche Diagnostics 的細胞凋亡ELISA 檢測試劑盒），室溫孵育2 h。洗滌3 次，加入二銨鹽，避光室溫孵育1 h。在多功能酶標儀中檢測吸光度（OD405），用其表示外周血NET 含量。

三、中性粒細胞與淋巴細胞比值（NLR）

收集3 組的中性粒細胞計數和淋巴細胞計數，計算NLR，公式為NLR=中性粒細胞計數/淋巴細胞計數。

四、統計學處理

采用SPSS 20.0 進行數據分析，符合正態分布的計量資料采用表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗（2 組）或單因素方差分析（3 組及以上）；3 組以上數據間的兩兩比較采用LSD 法。非正態分布計量資料采用中位數（四分位數間距）表示，組間比較采用非參數檢驗。計數資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman 相關分析探討外周血NET 含量與食管癌轉移的相關性，采用Pearson 相關分析探討NET 含量與NLR 的相關性；采用logistic 回歸分析外周血NET 含量是否為食管癌遠處轉移的危險因素；采用ROC 曲線評估外周血NET 含量對食管癌遠處轉移的預測價值，并計算曲線下面積（AUC）。P ＜ 0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、外周血NET 含量與食管癌遠處轉移密切相關

與對照組相比，食管癌患者外周血NET（MPO-DNA）含量和NLR 均升高，且遠處轉移組高于非遠處轉移組（NET：F = 61.486，P ＜ 0.001；NLR：F = 38.123，P ＜ 0.001），見表2。

表2 不同組研究對象外周血NET 含量及相關中性粒細胞指標的差異

Spearman 相關分析結果顯示：外周血中NET含量（r = 0.770， P ＜ 0.001）和NLR（r = 0.6943，P ＜ 0.001）均與食管癌遠處轉移密切相關。Pearson相關分析結果顯示：食管癌患者外周血NET 含量和NLR 亦密切相關（r = 0.404， P = 0.001）。

二、外周血NET 生成是食管癌遠處轉移的獨立危險因素

以食管癌是否遠處轉移為因變量，以外周血NET 含量和NLR 為自變量進行多因素logistic 回歸分析，結果顯示：患者外周血NET 含量升高是食管癌發生遠處轉移的獨立危險因素。見表3。

表3 食管癌轉移患者危險因素的多因素logistic 回歸分析

變 量 截斷值 AUC 值 P 值 95%CI 靈敏度/ % 特異度/ %外周血NET 含量 1.13 0.837 ＜ 0.001 0.737～0.937 76.00 74.29 NLR 2.18 0.664 0.021 0.525～0.803 60.00 71.43 NET 聯合NLR - 0.843 ＜ 0.001 0.744～0.943 84.00 77.14

三、外周血NET 生成對食管癌遠處轉移的預測價值

ROC 曲線分析結果顯示：外周血NET 含量預測食管癌遠處轉移的AUC 大于NLR（Z = 1.979，P = 0.048）；NET 聯合NLR 能夠提高預測食管癌遠處轉移的特異度和靈敏度。見表4 和圖1。

圖1 ROC 曲線評價外周血NET 含量對食管癌遠處轉移的預測價值

四、食管癌遠處轉移的亞組分析

根據ROC 曲線分析的NET 和NLR 的截斷值將食管癌患者分為2 組，分別對2 組患者遠處轉移率進行分析，結果顯示：外周血NET 含量 ≥1.13的食管癌患者遠處轉移率高于NET 含量 ＜ 1.13 患者（P ＜ 0.001）；NLR ≥2.18 的食管癌患者遠處轉移率高于NLR ＜ 2.18 患者（P ＜ 0.05）。見表5。

表5 食管癌遠處轉移的亞組分析

討 論

隨著對腫瘤發生和發展規律的深入研究，學者們發現全身炎癥反應在腫瘤的發生和發展中扮演著重要角色［8］。中性粒細胞可以分泌血管生長因子，促進腫瘤血管生成，加快腫瘤生長速度［9］。淋巴細胞是機體抗腫瘤的重要細胞之一，參與腫瘤細胞的凋亡過程［10］。NLR 反映機體炎性反應和抗炎反應之間的平衡，是預測炎癥性疾病預后的重

表4 ROC 曲線分析結果要指標［11］。近年來的研究亦表明NLR 與食管癌臨床病理特征及預后密切相關，可以作為食管癌和重癥胰腺炎患者預后的評估指標［5，12-15］。本研究亦提示術前外周血NLR ≥2.18 的食管癌患者發生轉移的風險高于NLR ＜ 2.18 患者。但NLR 預測食管癌的AUC、靈敏度和特異度均不佳，不適宜用于臨床診斷。分析其原因主要為中性粒細胞和淋巴細胞計數的影響因素眾多，因此不能真實反映腫瘤的轉移情況。

NET 是中性粒細胞捕殺入侵病原微生物的重要手段，然而近年來的研究顯示NET 與多種腫瘤的發生和發展密切相關。Ho-Tin-Noé 等（2009 年）在肺癌小鼠體內發現腫瘤組織中存在腫瘤相關的中性粒細胞和細胞外染色質的積聚，提示NET 在腫瘤組織中存在的可能［16］。Berger-Achituv 等（2013年）首次觀察到腫瘤組織內NET 生成量的增加與尤因肉瘤患者不良預后有關［17］。隨后，越來越多的證據表明NET 通過促進腫瘤細胞離開原發部位、降解細胞外基質、捕獲循環中的腫瘤細胞、誘導上皮間質化和促進血管生成來影響腫瘤的遠處轉移［18］。Zhang 等（2020 年）的研究證實了術前腫瘤組織中NET 含量的增加與食管癌患者不良預后密切相關［7］。但目前尚不清楚NET 生成在食管癌轉移中的作用。

本研究顯示，食管癌患者外周血NET 含量增加，且發生轉移患者外周血NET 含量高于未轉移患者。進一步研究顯示外周血NET 生成是食管癌遠處轉移的獨立危險因素，檢測其含量能夠預測食管癌轉移的發生，且其診斷價值優于NLR；聯合兩者可以提高診斷的靈敏度和特異度。分析其原因主要考慮以下2 個方面：首先，食管癌患者體內會形成一定的腫瘤微環境，大量的中性粒細胞被招募進入腫瘤微環境中，在多種因素刺激下形成NET，NET 通過與腫瘤細胞的相互作用促進腫瘤細胞的轉移。其次，腫瘤細胞所產生的各種因子作用于骨髓造血系統，導致外周血中性粒細胞計數顯著增加。

綜上所述，本研究證實了NET 生成是食管癌轉移的危險因素，檢測外周血NET 含量能夠預測食管癌轉移，聯合NLR 能夠提高NET 的預測價值。但本研究是單中心的小樣本研究，病例數較少，其結果需要多中心大樣本的研究來進一步驗證。