不同組織來源線粒體提取效率和質量的差異研究

張晗奕，彭翠平，袁玉川，張 清，劉 燕，周 興

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054； 2.陸軍軍醫大學 藥物研究所， 重慶 400030)

0 引言

線粒體是細胞氧化磷酸化和能量產生的細胞器，是維持細胞呼吸和細胞穩態的主要來源，有著“細胞能量工廠”的美稱[1]，線粒體的電子傳遞鏈(electron transport chain,ETC)是細胞能量的生產工廠，也是細胞中產生自由基的主要來源[2]。線粒體在產生腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)的同時，還對細胞的氧化應激、物質代謝、細胞程序性死亡等多種途徑的控制發揮著重要作用[3]。

研究表明，線粒體的結構和功能改變可能導致ATP耗竭、線粒體膜電位降低、活性氧過度產生、線粒體DNA突變或缺失等，進一步導致細胞凋亡、壞死，其功能障礙是多種疾病病理學的重要特征[4]。在膿毒性休克[5]、類風濕性關節炎[6]、全身性炎癥[7]等炎癥相關疾病中，線粒體功能障礙導致的細胞壞死、氧化應激反應以及ROS爆發是介導炎癥起始與進展的關鍵機制之一。因此，基于線粒體損傷已逐漸成為炎癥相關疾病機制與治療研究的重要熱點。

一方面，隨著線粒體相關研究的深入，基于離體線粒體的實驗研究已經成為線粒體相關的直接作用因子與機制的主要研究手段[8]；另一方面，離體線粒體亦被證實能通過線粒體移植策略快速替代靶細胞中受損線粒體功能，恢復細胞呼吸功能、ATP供應以及氧化應激調控，在體內外均表現出對炎癥性損傷的快速修復能力，成為線粒體損傷的熱點治療策略[9]，受到廣泛關注。

由于細胞系提取線粒體周期較長，且細胞傳代次數會影響線粒體質量，目前采用較多的線粒體提取通常為組織來源線粒體。然而，現有研究缺乏對不同組織來源提取線粒體的效率、產率、純度和質量的評價，而這些因素顯然對于基于離體線粒體的機制或治療研究有重要影響。選用合適的組織提取線粒體既能保證提取線粒體的結構完整，純度較高，還對線粒體功能的研究取得良好效果。因此，本研究首先初步對心、肝、脾、肺、腎、肌肉、外周血來源提取的線粒體功能進行了評價，根據提取難度、線粒體功能從中篩選出兩種最適提取的來源，接下來對小鼠肝臟、心臟組織提取線粒體的所需時間、產率、純度和線粒體活性的差異，遴選線粒體提取的最佳來源組織，為未來基于離體線粒體的各類研究提供重要的方法學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1實驗動物

雄性C57BL/6J小鼠，體質量18～24 g，6～8周齡，由陸軍軍醫大學實驗動物中心提供，飼養過程嚴格遵守3R原則。

1.1.2主要材料、試劑與儀器

組織線粒體分離試劑盒、增強型ATP檢測試劑盒、增強型膜電位檢測試劑盒(JC-1)、BCA蛋白濃度檢測試劑盒(增強型)、Western及IP細胞裂解液、Mito-Tracker Green (線粒體綠色熒光探針)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG (H+L)、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG (H+L)購自上海碧云天技術有限公司；蛋白酶抑制劑購自上海索萊寶生物科技有限公司；SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司；Anti-COX IV antibody購自英國Abcam公司；cytochrome C antibody購自維百奧北京生物科技有限公司，蛋白預染Maker和PVDF膜購自美國Thermo公司，牛血清蛋白(BSA)購自德國Sigma公司，β-actin (43D) monoclonal antibody購自中國北京博奧森生物技術有限公司。激光掃描共聚焦顯微鏡(日本尼康株式會社)，垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)，超靈敏多功能成像儀(美國GE公司)，Centrifuge 5430R 低溫超速離心機(德國 Eppendorf 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1線粒體的提取

小鼠禁食12 h后，腹腔注射4%的水合氯醛麻醉，待小鼠麻醉后，剪掉小鼠胡須，用消毒的鑷子眼球取血0.5 mL，消毒的剪刀沿小鼠腹中線剪開，取出心、肝、脾、肺、腎、肌肉，在磷酸緩沖液中沖洗多余的血液后稱重，取0.5 g的心、肝、脾、肺、腎、肌肉。將小鼠心、肝、脾、肺、腎、肌肉轉移至裝滿0.5 mL預冷的磷酸緩沖液中剪碎，冰上放置 3 min后，4 ℃，600 g離心30 s，棄上清，組織沉淀中加入8倍體積預冷的胰酶消化液，重懸，冰上消化20 min，4 ℃，600 g離心30 s。加入2倍體積預冷的線粒體裂解液A，重懸，去除胰酶消化液，4 ℃，600 g離心30 s，棄上清。沉淀中加入8倍體積的線粒體裂解液A，重懸，轉入至玻璃勻漿器中，在冰上勻漿20次后，收集勻漿液，1 000 g，重復試驗4次，4 ℃離心5 min，取上清，4 ℃離心10 min得線粒體。

1.2.2線粒體蛋白量的測定

使用BCA法檢測線粒體蛋白濃度。

1.2.3線粒體粒徑和zeta電位檢測

使用粒徑分析儀測定外周血、肝臟組織、心臟組織來源的線粒體粒徑大小。分別吸取1 mL液體置于玻璃檢測皿，充分混勻確保樣品均勻分散且無氣泡產生，室溫下平衡1 min，檢測粒徑大小。使用激光粒度分析儀測定的Zeta電位值。吸取制備的3種不同的溶液約1 mL于電位樣品池皿中，連接儀器正負極后將樣品放入，室溫下平衡1 min后測定Zeta電位值。

1.2.4透射電鏡觀察線粒體結構

離心得到的線粒體沉淀用2.5%戊二醛4 ℃固定過夜后，用磷酸緩沖液沖洗3次洗去固定液，加入1%鋨酸固定2 h，固定完成后磷酸緩沖液沖洗3次，經50%、70%、80%、90%和100%梯度的乙醇溶液脫水后，加入包埋劑37 ℃包埋1.5 h。切片機切片后用醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色后，透射電鏡下觀察線粒體超微結構。

1.2.5共聚焦觀察線粒體熒光

Mito-Tracker Green按照1∶5 000用細胞培養基稀釋至工作濃度后，37 ℃細胞培養箱避光染色30 min，用磷酸緩沖液清洗3次，用磷酸緩沖液重懸滴至載玻片上，共聚焦顯微鏡下觀察熒光強度。

1.2.6Western Blot檢測蛋白水平

線粒體提取的最后一步中，將上清加入適量含PMSF的裂解液冰上裂解，沉淀加入線粒體裂解液，冰上裂解后，用BCA檢測上清和線粒體沉淀的蛋白濃度。配膠，上樣，電泳，轉膜，BSA封閉液封閉1 h，敷一抗4 ℃過夜，洗膜，敷二抗室溫1 h，洗膜顯影觀察細胞色素C氧化酶4(cytochrome c oxidase IV，COX IV)和細胞色素C(cytochrome C)、增殖細胞核抗原PCNA、肌動蛋白β-actin的蛋白表達情況。

1.2.7檢測線粒體的ATP含量

用ATP標準品配制ATP標曲溶液，冰上用線粒體裂解液裂解相同量的線粒體懸液，充分混勻后，4 ℃，12 000 g離心5 min，小心吸取上清，取一部分用BCA檢測其蛋白濃度。取干凈的96孔黑板，每孔加入100 μL ATP檢測工作液，室溫靜置3 min，每孔再加入20 μL的標準品或樣品，用移液器反復吹打，立即化學發光法檢測ATP含量。

1.2.8線粒體膜電位檢測

取相同量的心臟、肝臟來源的線粒體懸液加入適量的JC-1檢測工作液后，置于37 ℃的細胞培養箱中孵育20 min。染色結束后，600 g，4 ℃離心3～4 min，取沉淀。洗滌線粒體2次,磷酸緩沖液重懸，加至96孔黑板中，酶標儀檢測紅綠熒光，紅綠熒光的比值即膜電位強度。

2 結果

2.1 不同組織來源對線粒體的功能影響

為了初步評價和篩選出高質量的線粒體,利用差速離心法(圖1(a))提取C57 BL/6J小鼠的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、外周血來源的線粒體，提取時間、提取量如圖1(b)、圖1(c)所示。根據線粒體的蛋白濃度對線粒體提取量進一步定量，結果如圖1(d)所示。

圖1 等量不同來源組織的線粒體水平評價

等量的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、外周血用相同方法提取線粒體時，雖然外周血提取較心其他組織來源線粒體的步驟簡單，耗時更少，但脾、外周血、肌肉來源提取的線粒體較少，心臟、肝臟來源的線粒體較多。由于外周血來源的線粒體提取較少，且呈紅色，對線粒體ATP、線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的評價有一定影響，因此只對心、肝、脾、肺、腎、肌肉來源提取的線粒體功能ATP、MMP進行評價，結果如圖1(c)、圖1(d)所示。肺、肌肉來源的線粒體ATP含量較高，心臟、脾臟次之，而比較MMP時，心臟來源的膜電位水平最優，其余組織的膜電位水平相當。綜上所述，肺來源提取線粒體的量、線粒體功能都是較優的，但由于肺的密度較低，在液體中呈漂浮狀，使提取難度加大，提取時間增多，如圖1(b)所示，且影響線粒體的提取質量。因此肺不作為線粒體提取的最佳來源。而肌肉雖然其ATP含量較高，但其線粒體提取量、MMP水平都較低，也不作為線粒體的提取最佳來源。而肝臟、心臟從提取的量、線粒體功能等方面來評價，都是具有一定優勢。因此，初步篩選出心臟、肝臟來源的線粒體作為線粒體提取來源的方案。

2.2 心臟、肝臟提取線粒體的表征

為了在心臟和肝臟兩種線粒體提取來源中，遴選質量更佳的方式，我們進一步對心臟、肝臟兩種不同來源提取的線粒體進行粒徑、zeta電位和線粒體數量的檢測。如圖2(a)、圖2(b)所示，肝臟組織、心臟組織提取的線粒體粒徑都在0.5～5 μm，在正常線粒體大小范圍內，并且心臟來源的線粒體較肝臟組織來源的線粒體粒徑更大。最后對相同量心臟、肝臟2種來源的線粒體Mito-traker Green染色后，共聚焦顯微鏡下觀察，檢測結果如圖2(c)、圖2(d)所示，染色確定了心臟和肝臟提取的都為線粒體，并且進一步驗證了相同質量的心臟組織和肝臟組織相比，心臟來源提取出的線粒體是多于肝臟，心臟來源的線粒體熒光強度也是強于肝臟來源的線粒體。

圖2 等量的肝臟、心臟組織的線粒體提取效率

2.3 肝臟、心臟提取線粒體的純度檢測

為了對確定2種不同來源提取線粒體的純度，利用Western Blot分析了心臟、肝臟的線粒體以及上清液的蛋白質水平。檢測結果如圖3(a)、圖3(b)所示，從心臟、肝臟分離的線粒體中都沒有胞漿標志蛋白β-actin和細胞核標志蛋白PCNA的表達，只有線粒體標志蛋白COX IV和cytochrome C的表達，證明兩種組織來源提取的線粒體純度都是較高的。而從圖3(a)看出上清液中沒有線粒體標志蛋白COX IV和cytochrome C的表達，而圖3(b)中肝臟提取的線粒體上清有一部分線粒體標志蛋白COX IV和cytochrome C表達，說明肝臟來源的線粒體沒有完全分離出來，還有少量線粒體存留在肝臟組織中。

2.4 肝臟、心臟提取線粒體的超微結構

為了分析提取不同來源線粒體的結構是否完整，透射電鏡觀察心臟、肝臟兩種來源的提取線粒體超微結構(圖4)，發現心臟提取的線粒體大多呈球形或桿形，并且形態結構完整，線粒體外膜完整，線粒體嵴理清晰，無其他細胞器污染，而肝臟來源的線粒體雖然無其他細胞器污染，但形態結構不完整，部分線粒體外膜破碎，線粒體嵴模糊不清或紊亂，通過比較2種不同來源的線粒體發現心臟來源的線粒體形態結構更完整。

圖3 肝臟、心臟提取線粒體的純度檢測

圖4 心臟、肝臟來源提取線粒體的透射電鏡圖

2.5 心臟、肝臟提取線粒體的線粒體功能分析

在確定了提取線粒體的純度和結構的情況下，進一步對提取的線粒體的生物活性進行分析，檢測了線粒體功能指標：線粒體ATP含量和膜電位強弱。線粒體作為“細胞能量工廠”。通過氧化磷酸化和糖酵解產生ATP，因此ATP是反映線粒體狀態及活性的關鍵指標。利用化學發光法檢測心臟、肝臟分離的線粒體ATP含量，結果如圖5(a)、圖5(b)所示，心臟和肝臟來源提取的線粒體都具有正常的生物活性，線粒體ATP含量都隨著線粒體的質量(5、25、50、100和200 μg) 呈劑量依賴性增加，但是，在相同質量的線粒體中，心臟來源的線粒體比肝臟來源的線粒體化學發光更強，即心臟來源的線粒體比肝臟來源的線粒體ATP含量更多，對圖5(a)、圖5(b)的化學發光強度進行統計分析，統計結果如圖5(c)所示。膜電位的強弱作為判斷線粒體功能的關鍵指標之一，用JC-1法檢測心臟、肝臟來源提取的線粒體膜電位，CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，會使膜電位顯著降低，將其作為陽性對照組。檢測結果如圖5(d)所示，陽性對照組經過CCCP處理后，較心臟線粒體組和肝臟線粒體組顯著降低，而心臟來源的線粒體膜電位與肝臟來源的線粒體相比顯著增高。進一步證明了2種來源提取的線粒體都具有正常的生物活性，但心臟線粒體功能比肝臟線粒體更好。

圖5 心臟、肝臟提取線粒體的線粒體功能分析

3 討論

線粒體是細胞中少數擁有獨立遺傳物質的細胞器，它可以為細胞的各種生命活動提供能量，參與細胞信號傳導和生長通路等[10]。研究發現線粒體自噬、線粒體生物學變化和線粒體DNA突變等線粒體障礙是炎癥反應的發生機制或進一步惡化的關鍵因素[11-13]。離體線粒體的研究已成為炎癥相關疾病中線粒體損傷機制研究以及治療研究的重要策略[14-15]。目前對于離體線粒體的提取原理大多是通過差速離心法，技術較為成熟[16]。然而，不同來源的線粒體在線粒體活性、線粒體數量以及提取時間上均具有較大的差異，會明顯影響到研究結果的科學性與準確性。因此，對不同組織來源提取線粒體的效率、產率、質量與活性的評價，以確定最適合的離體線粒體組織來源，對于線粒體功能研究來說具有重要的意義。

本研究選擇小鼠主要組織心、肝、脾、肺、腎、肌肉，以及外周血，系統比較了各種來源提取線粒體的提取量、線粒體功能的差異，并對其中提取效率最高的心臟和肝臟來源線粒體的形貌大小、線粒體相關蛋白水平以及線粒體生物活性進行了系統評價。

首先，在提取時間和具體方法的復雜性上，上述來源并無明顯區別，均是先將組織或外周血處理為單細胞懸液，再裂解細胞后，利用細胞器密度差異，通過差速離心獲得，但肺來源的線粒體由于肺組織的密度較低，對提取效率和提取結果存在一定的干擾，因此肺組織不作為線粒體提取的最佳來源。在線粒體提取效率方面，從相同量的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、外周血中提取線粒體，我們發現，外周血的提取獲得的線粒體產量最低。心臟和肝臟是小鼠中主要耗能器官，已被證實擁有豐富的線粒體[17]。因此，我們發現心臟和肝臟提取的線粒體產量最高，其中心臟提取的線粒體數量和質量均俱佳，這與心臟、肝臟的高耗能密切相關，也與其他在體對線粒體數量的研究基本相符[18-19]。而對線粒體功能評價表明，心臟和肝臟均來源的線粒體提取方法均具有較高的提取量、線粒體水平，而肌肉來源的線粒體提取量、MMP水平都較低，也不作為線粒體的提取最佳來源。

對于心臟和肝臟來源的線粒體，我們又進一步通過分析其中的胞漿蛋白、核蛋白以及線粒體膜蛋白、線粒體內膜蛋白的表達，比較了線粒體的純度，發現兩者均由較高的純度，并從線粒體提取后殘余細胞組分的分析，發現肝臟來源提取線粒體的產率較低的原因，可能其未完全提取肝細胞中線粒體有關。在線粒體質量與活性方面，我們發現心臟來源的線粒體更完整，外膜完整，線粒體嵴更清晰，心臟來源的線粒體ATP含量更多，膜電位也是高于肝臟來源的線粒體。因此，心臟來源的線粒體無論是從結構和生物學活性都是優于肝臟來源的線粒體。

綜上所述，本研究證明了心臟來源的線粒體提取在效率、純度、結構以及功能等方面都優于外周血和肝臟，一方面更適用于對非特定細胞中線粒體功能的研究，另一方面更佳的線粒體活性也更能充分發揮線粒體移植療法在疾病動物中的治療作用，因此本研究能對線粒體功能研究機制及線粒體移植治療的研究提供線粒體組織來源的實驗依據，對該領域的發展具有重要的推進作用。