食用植物油中甾醇總含量測定方法的優化

翟孟婷， 謝 亮， 林澤峰， 張江旭， 王翔宇,2， 惠 菊,2

(中糧營養健康研究院有限公司，營養健康與食品安全北京市重點實驗室， 老年營養食品研究北京市工程實驗室1，北京 102209) (江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心2，南京 210023)

甾醇是天然甾族化合物中的一類物質，按照來源可分為動物甾醇、植物甾醇和菌甾醇。植物甾醇是一種天然活性物質，通常為無色、無味、不溶于水、易溶于有機物，結構上與膽固醇相似[1]。植物甾醇主要來源于植物類食物，且大部分存在于油料種子中[2]。食用植物油中含有多種甾醇，甾醇含量相對較多的為稻米油、玉米油、葵花籽油、菜籽油，主要甾醇種類為菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇。植物甾醇應用范圍很廣，有助于降低血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇以及血清甘油三酯的濃度，添加到化妝品中可提高乳化穩定性，添加到飼料中可以提高禽畜的增重率[1]。目前食用植物油中甾醇提取方法主要為堿溶液加熱皂化提取結合液液萃取法[3，4]，薄層色譜法[5]或固相萃取法[6，7]凈化提純后上機測定。文獻報道的甾醇分析方法主要有氣相色譜法[6-8]，氣相色譜質譜法[9，10]，液相色譜法[11，12]，液相-氣相色譜聯用法[13，14]。氣相色譜法的分離度和靈敏度相對較好，設備價格相對較低且對操作人員要求不高等優勢，國家標準中使用堿液皂化-氧化鋁柱除雜-薄層板分離提純結合氣相色譜定量國家標準方法具有適用性廣，甾醇凈化率高的優勢，但因操作過程繁瑣且耗時長，無法批量處理。氣相色譜質譜法靈敏度和抗干擾力較強，是近幾年甾醇分析使用較多的方法。液相色譜對甾醇的分離穩定性相對較差，有文獻報道液相-氣相色譜聯用法，液相色譜對樣品進行分離，收集洗脫結合氣相色譜進行測定完成15種甾醇組分的分析，樣品前處理相對簡單易操作，但分析時間較長對設備的要求比較高，不能滿足快速測定需求[13]。

本研究選擇前處理方法簡單且設備靈敏度和分離度能滿足要求的檢測方法，在改進國家標準方法基礎上，優化樣品前處理過程，人員實驗技能要求較低同時滿足油脂工廠快速測定甾醇的要求，結合氣相色譜完成甾醇化合物分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

甾醇標品∶膽固醇99%，菜籽甾醇，豆甾醇，菜油甾醇，β-谷甾醇。

衍生化試劑(BSTFA∶TMCS=99∶1)，正己烷，色譜純； 95%乙醇，分析純；氫氧化鉀， 無水硫酸鈉，15 mL塑料離心管。

1.2 儀器與設備

7890B氣相色譜-FID檢測器，HP-5色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，TTL-DC11氮吹儀，ST-16R離心機，水浴鍋，渦旋混合器，ME-204天平。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

膽固醇標準溶液：準確稱量100 mg膽固醇標品(準確到0.100 mg)，用正己烷溶解，于25 mL容量瓶中定容。將溶液轉移至棕色試劑瓶中，密封后，置于-20 ℃保存1周。

菜籽甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇標準溶液(1.00 mg/mL)：分別準確稱量5 mg甾醇標品(準確到0.100 mg)，用正己烷溶解，于5 mL容量瓶中定容。將溶液轉移至棕色試劑瓶中，密封后，在-20 ℃保存3個月。

菜油甾醇標準溶液(0.10 mg/mL)：稱量1 mg菜油甾醇標品，取少量正己烷于標準品瓶中重復3次，將標準品溶解后轉移至進樣瓶中，密封后，在-20 ℃保存3個月。

甾醇工作溶液：量取1 mL菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇標準溶液于進樣瓶中衍生化后，氣相色譜定性分析。

1.3.2 樣品處理

稱取200 mg樣品于15 mL離心管中，依次加入500 μL內標溶液，2 mol/mL氫氧化鉀-乙醇溶液1 mL，渦旋1 min，混勻，超聲3 min，取出后加入4 mL KOH-乙醇溶液，渦旋1 min后放入60 ℃水浴鍋中加熱1 h，取出后冷卻。加入2 mL去離子水，5 mL正己烷，渦旋后4 000 r/min離心10 min，將上層溶液轉移至另一15 mL離心管中，重復提取2次，加入1 g無水硫酸鈉。將提取液氮吹至2 mL，離心后過0.22 μm有機濾膜，轉移至進樣瓶中，氮吹至干，再加入400 μL衍生化試劑，60 ℃水浴加熱1 h，上機分析。

1.3.3 氣相色譜條件

HP-5毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，載氣：高純氮氣，純度99.999%；恒壓，16.349 psi；分流比：20∶1；進樣口溫度：320 ℃；檢測器溫度：320 ℃；程序升溫：初始溫度240 ℃，保持1 min，以4℃/min的速率從240 ℃升溫到255 ℃，保持35 min；進樣量：1.0 μL。

1.3.4 結果計算

本方法的甾醇總量計算方法，參考GB/T 25223—2010，甾醇總量的計算從菜籽甾醇到Δ7-燕麥甾烯醇所有甾醇的峰。

式中：S為試樣中甾醇總量，以100 g油中含有的質量表示/mg/100 g；mB為膽固醇的質量/mg；Σ(A)為單體甾醇峰面積的和;AB為膽固醇內標峰面積；mT為試樣的質量/g。

1.3.5 數據分析

本文樣品測定方法的甾醇總量計算方法參考GB/T 25223—2010，實驗數據用Excel表分析，用Origin軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 前處理條件優化

2.1.1 堿液濃度

稱取200 mg樣品按照分別添加0.5、1、2、2.5 mol/mL濃度堿液5 mL，進行樣品前處理后上機分析。探究堿液濃度對甾醇含量的影響，結果見圖1。堿液濃度增加有助于皂化物的提取，堿液濃度2.5 mol/mL 和2 mol/mL時，甾醇總量值上升為最大值，堿液濃度過高時，溶液黏度略大，不利于萃取，因此濃度為2 mol/mL最優。

2.1.2 提取溶劑用量

因乙醚與乙醇容易發生乳化反應，回收率略低于正己烷[15]。本實驗選擇正己烷為提取溶劑，并對正己烷的用量進行探究。核桃油中豆甾醇本底值較低為14.25 mg/kg。稱取核桃油200 mg，添加豆甾醇標品200 μg，按照1.3.2進行前處理，選取正己烷4、8、10、12 mL對皂化液進行2次萃取，上機分析。豆甾醇回收率隨著正己烷用量增加而增高在10 mL后開始。在本實驗條件下，正己烷用量4 mL時，有乳化現象分層不明顯。當正己烷用量8、10 mL時回收率最高，分別為99.72%、100.21%，過多的提取液在氮吹濃縮耗時較長因此本實驗選擇使用正己烷8 mL，結果見圖1。

圖1 堿液濃度以及正己烷用量對甾醇的影響

2.1.3 前處理條件對結果影響探究

薄層色譜分離可以將不皂化物中的甾醇與烴類、三萜烯醇和甲基甾醇等分開，其分離效果影響甾醇結果的準確性[16]。本研究省略薄層色譜分析步驟，具有快速測定批量處理的優勢，探究本方法與GB/T 25223—2010測定甾醇總量結果差異，選取2個玉米毛油結果進行比較，結果見表1。對2個樣品的2個總體均值之差檢驗，計算的2個P值，均大于P=0.05，因此2種檢測方法差異性不顯著。

表1 2種方法測定玉米油中甾醇總量表

2.2 色譜分離

本實驗使用Aglient HP-5非極性毛細管柱，具有良好的惰性和熱穩定性，可以較短時間內實現甾醇完全分離。菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇標準品色譜圖，如圖2所示。

注：1 菜籽甾醇；2 菜油甾醇；3 豆甾醇；4 β-谷甾醇。圖2 4種甾醇標品色譜圖

2.3 甾醇鑒定

國家標準方法中將氫氣作為載氣，使用SE-54色譜柱進行分離給出甾醇的相對保留時間，因氫氣在實驗室安全風險系數較高，對氣體儲存要求極高，不適用于一般實驗室。所以本方法使用氮氣作為載氣， HP-5色譜柱分離測定相對保留時間(RRT)鑒定植物油中的甾醇種類，以待測甾醇保留時間除以膽固醇的保留時間(RT)，表2列出了在本實驗條件下12種甾醇的相對保留時間。

表2 甾醇相對保留時間表

表3 方法添加回收率

表4 4種食用植物油中甾醇含量測定值/mg/kg

表5 6種食用植物油中甾醇含量測定值/mg/kg

2.4 回收率和精密度

考慮樣品本底值的基礎上，對核桃油進行4類甾醇3種濃度水平進行3次添加回收實驗，其中菜籽甾醇回收率為85.42%～91.44%，菜油甾醇回收率為87.51%～91.89%，豆甾醇回收率為89.25%～98.10%，β-谷甾醇回收率為85.13%～94.80%，該方法的相對標準偏差為1.43%～3.72%。β-谷甾醇低濃度添加回收率略低，可能與樣品本底值較高有關，詳見表3。

2.5 方法檢出限和定量限

本文保證結果的穩定性和準確性，樣品加入內標定量。標品儲備液逐級稀釋，以3倍信噪比(S/N)計算方法的檢出限(LOD)為0.11 mg/kg，10倍信噪比計算定量限(LOQ)為0.25 mg/kg。

2.6 不同植物油中的甾醇含量

食用植物油中主要以菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇為主。由表4、表5可知，菜油甾醇在7種油中含量較高，β-谷甾醇在10種油中含量最高，豆甾烯醇在山茶油、胡麻籽油和芝麻油中含量較高，菜油甾烯醇僅在稻米油中檢出。花生油、葵花籽油，山茶油和胡麻籽油甾醇總量在2 839～4 798 mg/kg范圍內，核桃油甾醇總量最低為1 794.22 mg/kg。稻米油甾醇總量最高為22 082mg/kg，其次為玉米油11 000～13 000 mg/kg，這2種油的Δ5-燕麥甾烯醇和Δ5，24-豆甾烯醇含量高于其他品類油。

3 結論

本文建立快速測定油脂中甾醇方法，在國家標準基礎上進行優化，樣品氫氧化鉀乙醇溶液加熱皂化后少量正己烷提取，氮吹濃縮衍生反應后，利用氣相色譜進行12種甾醇分析。本方法簡便高效，適合高通量處理且減少有機試劑使用量，節省實驗成本同時對實驗人員友好健康，滿足油脂工廠快速測定甾醇的需求。