帕金森病患者血清circRNA DLGAP4和circRNA SAMD4A表達與病情嚴重程度及認知障礙相關性研究

柴琴琴，范磊，劉星亮，岳秉宏

帕金森病(Parkinson's disease，PD)可表現為運動遲緩、靜止性震顫、嗅覺減退、認知障礙等，嚴重影響患者正常生活[1-2]。既往研究發現，PD發生發展與感染、氧化應激、炎性反應、環境、自噬、環狀RNA(circular RNA，circRNA)異常表達有關[3-4]。circRNA作為一類環狀非編碼RNA分子，其在PD中表達失調，可作為診斷PD、評估PD嚴重程度的標志物[5]。近期研究顯示，環狀RNA DLGAP4(circRNA DLGAP4)作為circRNA家族的一員，其在PD中表達下調，circRNA DLGAP4可通過減少線粒體損傷、增強自噬，進而在PD中發揮神經保護作用[6]。另外，環狀RNA SAMD4A(circRNA SAMD4A)在PD中呈高表達，其可能在PD發生發展中起促進作用[7]。基于上述研究，本研究通過測定circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A在PD患者血清中的表達水平，旨在分析其與PD嚴重程度、認知障礙的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年10月—2022年3月河北北方學院附屬第一醫院神經內三科收治的PD患者95例為PD組，男53例，女42例，年齡50～75(63.95±9.08)歲。并選擇同期體檢健康者95例為健康對照組，男50例，女45例，年齡50～75(62.37±8.74)歲。2組性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準(L2019-147)，全部受試對象及其家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①符合“中國帕金森病的診斷標準(2016版)”[8]中PD診斷標準；②初診PD患者；③臨床資料完善。(2)排除標準：①患有阿爾茨海默病、PD疊加綜合征、血管性癡呆或其他嚴重精神疾病史者；②患有急慢性感染性疾病或伴有肝、腎功能不全者；③患有自身免疫性/內分泌代謝疾病、腫瘤者。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A表達水平檢測：收集PD患者確診后24 h內及體檢健康者體檢當日空腹外周血5 ml，自然凝集離心留取血清，存于-80℃冰箱待測。解凍血清，使用Trizol試劑提取總RNA；之后，應用反轉錄試劑盒合成cDNA(Trizol試劑及試劑盒均購自上海慧穎生物科技有限公司)；最后利用PCR試劑盒和qRT-PCR儀將cDNA擴增，并確定循環閾值(CT)。擴增條件：98℃ 8 min，97℃ 20 s，64℃ 25 s，70℃ 10 s，40個循環。circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A均以GAPDH為內參基因，引物序列見表1。circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A相對表達量以2-△△CT法計算。PCR儀、PCR試劑盒及引物購自江蘇弘麒生物科技有限公司。

表1 基因引物序列

1.3.2 臨床癥狀評分與分組：對所有PD患者進行蒙特利爾認知評估量表(MoCA)評分[9]，根據評估結果將PD患者分為認知正常亞組54例(MoCA評分≥26分)和認知障礙亞組41例(MoCA評分<26分)。采用Hoehn-Yahr(H-Y)分期[10]評估所有PD患者嚴重程度，將其分為1期亞組33例、2～3期亞組44例、4～5期亞組18例。

2 結 果

2.1 組間血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A表達水平及MoCA評分比較 與健康對照組比較，PD組患者血清circRNA DLGAP4表達水平、MoCA評分降低(P<0.01)，血清circRNA SAMD4A表達水平升高(P<0.01)，見表2。

表2 健康對照組、PD組血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A水平及MoCA評分比較

2.2 不同認知程度PD患者臨床資料比較 認知障礙亞組PD患者年齡、血清circRNA SAMD4A表達水平高于認知正常亞組，而受教育年限、血清circRNADLGAP4表達水平、MoCA評分均低于認知正常亞組(P<0.05)，2亞組PD患者性別、飲酒、吸煙、高血壓、糖尿病比例、PD家族史、PD臨床分型比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 認知正常亞組與認知障礙亞組PD患者臨床資料比較

2.3 不同嚴重程度PD患者血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A表達水平及MoCA評分比較 1期亞組、2～3期亞組、4～5期亞組PD患者血清circRNA DLGAP4表達水平、MoCA評分依次降低(P<0.01)，血清circRNA SAMD4A表達水平依次升高(P<0.01)，見表4。

表4 不同嚴重程度PD患者血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A表達水平及MoCA評分比較

2.4 PD患者血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A表達水平與MoCA評分的相關性 Pearson法分析顯示，PD患者血清circRNA DLGAP4表達水平與MoCA評分呈正相關(r=0.557，P<0.001)，血清circRNA SAMD4A表達水平與MoCA評分呈負相關(r=-0.598，P<0.001)。

2.5 多因素Logistic回歸分析PD患者發生認知障礙的影響因素 以PD患者是否發生認知障礙為因變量(發生=1，不發生=0)，以年齡、受教育年限、circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A為自變量，進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，受教育年限長、血清circRNA DLGAP4高是PD患者發生認知障礙的保護因素(P<0.01)，年齡大、血清circRNA SAMD4A高是其危險因素(P<0.01)，見表5。

表5 PD患者發生認知障礙的多因素Logistic回歸分析

2.6 血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A預測PD患者發生認知障礙的價值 繪制ROC曲線結果顯示，血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A及二者聯合診斷PD患者發生認知障礙的AUC分別為0.791、0.852、0.948，二者聯合診斷的AUC優于血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A單獨診斷(Z=2.950、2.081，P=0.003、0.037)，見圖1、表6。

表6 血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A對PD患者發生認知障礙的診斷價值

圖1 血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A診斷PD患者發生認知障礙的ROC曲線

3 討 論

PD是一種不可逆、呈進行性加重的神經退行性疾病，其病程長，通常給予對癥治療，多數患者在5～8年后生活幾乎不能自理[10-13]。因此，尋找與PD病理發展相關，且可評估PD嚴重程度的標志物，對及時制定針對性治療方案，延緩PD患者病情尤為重要。

circRNA結構穩定，能調控微小RNA表達，且可參與蛋白質翻譯，與亨廷頓病、阿爾茨海默病、癲癇、PD等神經系統疾病關系密切[14-16]。研究發現，circRNA DLGAP4作為circRNA家族的成員之一，其在急性缺血性腦卒中(AIS)中呈低表達，circRNA DLGAP4可通過抑制神經炎性反應、氧化應激反應，進而減輕腦卒中損傷，circRNA DLGAP4可作為診斷AIS、評估AIS嚴重程度的潛在指標[17]。另外，Qiu等[18]研究認為，過表達circRNA DLGAP4可通過增加神經細胞活力，抑制神經細胞凋亡，降低炎性反應水平，從而緩解神經元損傷。本研究顯示，PD患者血清circRNA DLGAP4表達水平較健康者低，與Feng等[6]研究趨勢相符，提示circRNA DLGAP4表達水平降低可能與PD發生發展密切相關，推測circRNA DLGAP4可能通過影響氧化應激、神經炎性反應及神經細胞活力，進而影響PD進程。本研究發現，circRNA DLGAP4表達水平隨PD患者病情加重而呈降低趨勢，表明檢測血清circRNA DLGAP4表達水平有利于臨床評估PD患者病情，circRNA DLGAP4有望成為評估PD嚴重程度的血清指標。近期報道顯示，circRNA SAMD4A在心肌梗死中表達水平升高，可通過促進細胞凋亡、炎性反應進而促進心肌梗死[19]。此外，Wang等[7]研究發現，circRNA SAMD4A可通過影響自噬，促進多巴胺能神經元凋亡，進而促進PD病理變化。本研究中PD患者血清circRNA SAMD4A表達水平較健康者高，與Wang等[7]研究趨勢一致，且PD患者病情越嚴重，血清circRNA SAMD4A表達水平越高，提示其可能參與PD病變過程，且circRNA SAMD4A具有判定PD患者疾病嚴重程度的潛在價值，分析可能原因，circRNA SAMD4A可能通過促進多巴胺能神經元凋亡，影響機體自噬，從而影響PD疾病進展。本研究ROC曲線分析發現，血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A對PD患者發生認知障礙有一定診斷價值，可能是診斷PD患者發生認知障礙的潛在指標，且二者聯合診斷可能更有利于臨床判定PD患者發生認知障礙，為臨床診治PD認知障礙提供新方法。

認知障礙是PD患者中較為常見的一種非運動癥狀，MoCA評分是評估認知障礙的常用方法，其操作簡便，易于理解[20-23]。本研究顯示，PD患者MoCA評分較健康者低，且H-Y分期越高，MoCA評分越低，提示PD患者存在認知損傷，且MoCA評分可輔助判斷PD嚴重程度。另外，經相關性分析發現，PD患者MoCA評分與血清circRNA DLGAP4表達水平呈正相關，與血清circRNA SAMD4A表達水平呈負相關，提示circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A可能與PD患者認知障礙有關。且本研究發現，發生認知障礙的PD患者受教育年限較短，年齡較大，血清circRNA DLGAP4表達水平、MoCA評分較低，血清circRNA SAMD4A表達水平較高，進一步提示血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A表達水平、受教育年限、年齡可能與PD患者發生認知障礙關系緊密[24-26]。此外，多因素Logistic回歸分析發現，血清circRNA DLGAP4表達水平降低、circRNA SAMD4A表達水平升高、受教育年限較短、年齡較大均可能會增加PD患者發生認知障礙的風險，及時監控血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A等指標水平，對臨床預防PD患者發生認知障礙甚是有益。

綜上，PD患者血清circRNA DLGAP4表達下調，circRNA SAMD4A表達上調，兩者表達水平與PD嚴重程度、認知障礙密切相關，有望成為臨床評估PD患者病情、判斷PD患者是否發生認知障礙的輔助指標。但本研究有一定局限性：納入樣本較少，且本研究尚未探究血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A與PD患者預后的關系，后期將擴大樣本，進行跟蹤隨訪，展開深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

柴琴琴：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫，進行統計學分析；范磊：課題設計，提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；劉星亮、岳秉宏：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改