急性呼吸窘迫綜合征患兒血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平變化及臨床意義

宋宇雷，曹建設(shè)，王承娟，賀杰，肖政輝，張新萍

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由肺泡表面活性劑的原發(fā)性或繼發(fā)性減少引起的一種以氣體交換異常和急性低氧性呼吸衰竭為特征的呼吸系統(tǒng)疾病，進(jìn)展快、預(yù)后差，是導(dǎo)致兒科重癥監(jiān)護(hù)室患兒死亡的重要原因[1-2]。及時(shí)評(píng)估ARDS患兒病情嚴(yán)重程度和預(yù)后對(duì)患兒預(yù)后改善有重要意義。研究表明，失控性炎性反應(yīng)和肺泡上皮細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷參與ARDS發(fā)生發(fā)展[3-4]。微小RNA(microRNA，miRNA)參與多種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在ARDS炎性反應(yīng)中扮演重要角色[5]。研究報(bào)道，上調(diào)miR-499-5p表達(dá)能抑制膿毒癥誘導(dǎo)的肺組織炎性反應(yīng)[6]。基質(zhì)金屬蛋白酶16(matrix metallopeptidase 16，MMP-16)是一種膜結(jié)合型酶，能通過激活MMP2、MMP9參與上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[7-8]。目前，關(guān)于血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平與ARDS患兒病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系尚無研究報(bào)道，因此現(xiàn)對(duì)其進(jìn)行研究以期為改善ARDS患兒預(yù)后提供參考依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月—2022年1月湖南省兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科收治的ARDS患兒105例作為ARDS組，其中男71例，女34例；年齡1～12(5.68±1.56)歲；體質(zhì)量12～51(25.47±6.22)kg；ARDS病因：感染54例，創(chuàng)傷22例，肺栓塞24例，其他5例；參考“小兒急性呼吸窘迫綜合征：小兒急性肺損傷會(huì)議共識(shí)推薦”[9]根據(jù)氧指數(shù)(OI)分為輕度亞組39例(OI 4～<8)、中度亞組42例(OI 8～<16)、重度亞組24例(OI≥16)。并根據(jù)ARDS患兒28 d臨床結(jié)局分為存活亞組88例和死亡亞組17例。另選取同期醫(yī)院體檢健康兒童47例為健康對(duì)照組，其中男29例，女18例；年齡1～12(5.74±1.60)歲；體質(zhì)量12～54(25.42±5.62)kg；2組兒童一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019倫字023)，受試兒家屬或監(jiān)護(hù)人知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合“小兒急性呼吸窘迫綜合征：小兒急性肺損傷會(huì)議共識(shí)推薦”[9]中小兒ARDS診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡1～12歲。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①先天性疾病；②膈疝、表面活性物質(zhì)、肺腺瘤樣畸形等遺傳性缺陷；③腦性過度換氣；④惡性腫瘤；⑤嚴(yán)重肝腎功能障礙；⑥資料不全。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA檢測(cè)：收集ARDS組入院時(shí)、健康對(duì)照組入組時(shí)受試兒肘靜脈血3 ml，離心取上層血清保存于-80℃冰箱中待測(cè)。Trizol試劑盒(上海冠泰生物科技有限公司)提取血清總RNA，純度、濃度合格后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa Bio公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體積10 μl：5×PrimeScript RT Master Mix 2.0 μl、RNA 2.0 μl、RNase Free H2O 6.0 μl；反應(yīng)條件：37℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min、85℃逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)5 s、4℃反應(yīng)至結(jié)束后保存于-20℃冰箱中。按照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(日本TaKaRa Bio公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：miR-499a-5p正向引物 5′-ACTGCTTAAGACTTGGAGTGA-3′，反向引物 5′-TACATTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3′；內(nèi)參U6正向引物 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；MMP-16 mRNA正向引物 5′-AGCACTGGAAGACGGTTGG-3′，反向引物 5′-CTCCGTTCCGCAGACTGTA-3′；內(nèi)參GAPDH正向引物 5′-GCAAATTCCATGGCACCGT-3′，反向引物 5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′。PCR反應(yīng)體積20 μl：SYBR?Premix Ex Taq 10 μl、正反向引物各0.8 μl、cDNA模板2.0 μl、ROX Reference Dye 0.4 μl、RNase Free H2O 6.0 μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性90 s、95℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸15 s，循環(huán)40次后收集熔解曲線，采用2-ΔΔCT法計(jì)算血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 動(dòng)脈血?dú)夥治觯篈RDS患兒入兒科重癥監(jiān)護(hù)室后首次機(jī)械通氣時(shí)與健康對(duì)照組體檢時(shí)采用丹麥雷度米特ABL9血?dú)夥治鰞x進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治觯▌?dòng)脈血二氧化碳分壓(PaCO2)、動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)、血氧飽和度(SaO2)、吸入氧濃度、平均氣道壓，并計(jì)算氧指數(shù)(oxygen index，OI)=吸入氧濃度×平均氣道壓×100/PaO2。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平比較 ARDS組血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平分別為(1.27±0.31)、(3.08±0.62)，健康對(duì)照組分別為(2.85±0.46)、(1.07±0.37)，ARDS組血清miR-499a-5p水平低于健康對(duì)照組，MMP-16 mRNA水平高于健康對(duì)照組(t=21.349、24.932，P均<0.001)。

2.2 不同亞組間ARDS患兒血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平比較 輕度亞組、中度亞組、重度亞組血清miR-499a-5p水平依次降低，MMP-16 mRNA水平依次升高(P均<0.01)。死亡亞組血清miR-499a-5p水平低于存活亞組，MMP-16 mRNA水平高于存活亞組(P均<0.01)，見表1。

表1 不同亞組ARDS患兒血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平比較

2.3 2組動(dòng)脈血?dú)夥治霰容^ ARDS組PaCO2、OI高于健康對(duì)照組，PaO2、SaO2低于健康對(duì)照組(P均<0.01)，見表2。

表2 ARDS組與健康對(duì)照組動(dòng)脈血?dú)夥治鲋笜?biāo)比較

2.4 ARDS患兒血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平與血?dú)夥治鲋笜?biāo)的相關(guān)性 經(jīng)https://www.targetscan.org/vert_72/網(wǎng)站預(yù)測(cè)，miR-499a-5p與MMP-16的3′-非翻譯區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。Pearson/Spearman相關(guān)性分析顯示，ARDS患兒血清miR-499a-5p與MMP-16 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.603，P<0.001)；ARDS患兒血清miR-499a-5p水平與PaCO2、OI呈負(fù)相關(guān)，與PaO2、SaO2呈正相關(guān)(P均<0.01)，MMP-16 mRNA水平與PaCO2、OI呈正相關(guān)，與PaO2、SaO2呈負(fù)相關(guān)(P均<0.01)，見表3。

圖1 miR-499a-5p與MMP-16結(jié)合位點(diǎn)示意圖

表3 ARDS患兒血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平與血?dú)夥治鲋笜?biāo)的相關(guān)性

2.5 血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平對(duì)ARDS患兒死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線分析顯示，血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)ARDS患兒死亡的AUC分別為0.793、0.781、0.888，二者聯(lián)合預(yù)測(cè)ARDS患兒死亡的AUC大于單獨(dú)預(yù)測(cè)(Z=1.995、2.162，P=0.046、0.031)，見表4、圖2。

圖2 血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平單獨(dú)與聯(lián)合預(yù)測(cè)ARDS患兒死亡的ROC曲線

表4 血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平及二者聯(lián)合對(duì)ARDS患兒死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討 論

小兒ARDS是臨床常見的危重癥，與成人ARDS具備肺容積減少、肺順應(yīng)性降低和通氣/血流比值失常等相似的病理特征，但在病因、危險(xiǎn)因素、合并癥和治療預(yù)后方面仍存在較大差異[10]。2015年國(guó)際上首次制定了小兒ARDS共識(shí)，新共識(shí)根據(jù)OI或脈氧飽和度指數(shù)定義小兒ARDS和病情分級(jí)，而非成人ARDS的氧合指數(shù)[9-11]。盡管近年來高級(jí)呼吸護(hù)理、外源性表面活性劑、營(yíng)養(yǎng)和液體管理、皮質(zhì)類固醇等方式和藥物極大地改善了ARDS患兒預(yù)后，但病死率仍高達(dá)17.3%～21.2%[2,12]。因此，早期評(píng)估其病情嚴(yán)重程度和預(yù)后意義重大。

研究表明，失控性炎性反應(yīng)參與ARDS發(fā)生發(fā)展，各種病因能直接或間接通過炎性反應(yīng)破壞肺泡—毛細(xì)血管屏障中的肺泡上皮和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮，導(dǎo)致肺水腫和血管通透性增加，使肺功能持續(xù)惡化[3]。miRNA是一類小非編碼RNA分子，通過與mRNA的3′-非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì)調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而參與ARDS發(fā)生發(fā)展[13-14]。如miR-223能靶向NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3抑制肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和凋亡[15]。miR-224能靶向抑制p21增加肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[16]。miR-499a-5p是一種高度保守的miRNA，定位于人20號(hào)染色體q11.22，既往研究多報(bào)道其與惡性腫瘤的關(guān)系，近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-499a-5p還是一個(gè)與炎性反應(yīng)密切相關(guān)的miRNA。在脂多糖建立膿毒癥心肌功能障礙模型中，上調(diào)miR-499a-5p能抑制膿毒癥心肌功能障礙發(fā)生[17]。Guan等[18]通過氧—糖剝奪建立星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-499a能靶向第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)。上述研究提示，miR-499a-5p具有抗炎作用。且近期研究指出，miR-499-5p能靶向SRY-Box轉(zhuǎn)錄因子6抑制膿毒癥誘導(dǎo)的肺損傷[6]。本研究結(jié)果顯示，ARDS患兒血清miR-499a-5p水平明顯降低，且隨著病情加重而降低，說明血清miR-499a-5p水平降低參與小兒ARDS發(fā)生發(fā)展，分析可能與miR-499a-5p具有抗炎作用有關(guān)。段凌霄等[19]研究也報(bào)道，在盲腸穿刺構(gòu)建的ARDS大鼠模型中，上調(diào)miR-499a-5p表達(dá)能抑制肺泡上皮細(xì)胞中白介素-1β、白介素-6、腫瘤壞死因子-α等促炎因子表達(dá)，減輕ARDS大鼠肺組織損傷。

肺泡上皮、肺毛細(xì)血管內(nèi)皮和基底膜等構(gòu)成的肺泡—毛細(xì)血管屏障破壞是ARDS發(fā)生的核心環(huán)節(jié)，基底膜降解是肺泡—毛細(xì)血管屏障破壞的重要原因之一[20-21]。MMPs是多種組織和細(xì)胞產(chǎn)生的一種膠原蛋白水解酶，因其能降解細(xì)胞外基質(zhì)的各種蛋白組分而受到廣泛關(guān)注，同時(shí)MMPs還能導(dǎo)致細(xì)胞—基質(zhì)和細(xì)胞—細(xì)胞間作用變化，激活多種細(xì)胞因子和表面受體，參與炎性反應(yīng)發(fā)生發(fā)展[22]。MMP2和MMP9是MMP家族常見成員，近年研究表明，MMP2、MMP9能通過炎性反應(yīng)和降解細(xì)胞外基質(zhì)破壞肺泡—毛細(xì)血管屏障，參與ARDS發(fā)生發(fā)展[23-25]。MMP-16是MMPs家族中的一種膜結(jié)合型酶，也被稱為膜型MMP2和膜型MMP3，能通過切割MMP2、MMP9的前結(jié)構(gòu)域促進(jìn)MMP2、MMP9激活[8]。本研究結(jié)果顯示，ARDS患兒血清MMP-16 mRNA水平明顯升高，且隨著病情加重而升高，說明血清MMP-16 mRNA水平升高參與小兒ARDS發(fā)生發(fā)展，分析可能與MMP-16 mRNA表達(dá)上調(diào)能促進(jìn)MMP2、MMP9表達(dá)，二者通過炎性反應(yīng)和降解細(xì)胞外基質(zhì)破壞肺泡—毛細(xì)血管屏障參與ARDS發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究通過TargetScan 7.2數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-499a-5p與MMP-16的3′-非翻譯區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，Pearson相關(guān)性分析也顯示，二者在ARDS患兒血清中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-499a-5p與MMP-16可能共同參與小兒ARDS發(fā)生發(fā)展。有研究通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，上調(diào)miR-499a-5p能靶向下調(diào)MMP-16表達(dá)，降低肺泡中促炎細(xì)胞因子表達(dá)，減輕ARDS大鼠的肺損傷[19]。進(jìn)一步證實(shí)miR-499a-5p、MMP-16共同參與ARDS發(fā)生發(fā)展。本研究通過分析血清miR-499a-5p、MMP-16水平與ARDS患兒預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，與存活亞組比較，死亡亞組血清miR-499a-5p水平明顯降低而MMP-16 mRNA水平明顯升高，提示血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平還與ARDS患兒預(yù)后有關(guān)。ROC曲線分析也顯示，血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平預(yù)測(cè)ARDS患兒死亡的AUC分別為0.793、0.781，說明二者可作為ARDS患兒預(yù)后的輔助預(yù)測(cè)指標(biāo)。分析原因可能是血清miR-499a-5p越低和MMP-16 mRNA水平越高反映ARDS患兒肺泡—毛細(xì)血管屏障破壞越嚴(yán)重，導(dǎo)致肺功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)一步惡化，因此死亡風(fēng)險(xiǎn)更高。同時(shí)本研究ROC曲線分析還顯示，血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平聯(lián)合預(yù)測(cè)ARDS患兒死亡的AUC為0.888，較二者單獨(dú)預(yù)測(cè)的AUC顯著增加，說明聯(lián)合檢測(cè)血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平能提升ARDS患兒預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值，有利于指導(dǎo)臨床制定治療對(duì)策以改善ARDS患兒預(yù)后。

綜上所述，ARDS患兒血清miR-499a-5p水平低表達(dá)，MMP-16 mRNA水平高表達(dá)，二者可能共同參與小兒ARDS發(fā)生發(fā)展，與ARDS患兒病情嚴(yán)重程度和預(yù)后密切相關(guān)，可作為ARDS患兒預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)。但本研究樣本量較少，還需多中心大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)；同時(shí)關(guān)于miR-499a-5p、MMP-16參與ARDS的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

宋宇雷：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫;曹建設(shè)：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫;王承娟：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；賀杰：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；肖政輝、張新萍：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核