動(dòng)物源性面制品中氨基脲來(lái)源分析

郭思言，王俊蘇，郗存顯，唐柏彬，鄭小玲，莫 敏，鄭 文，關(guān)天橫，李賢良

（重慶海關(guān)技術(shù)中心，重慶 400020）

氨基脲（Semicarbazlde，SEM）又稱氨基甲酰肼，是一種聯(lián)胺類小分子化合物，通常被認(rèn)為是抗生素呋喃西林藥物的特征性代謝物[1]。SEM致癌性強(qiáng)，國(guó)外對(duì)呋喃西林藥物實(shí)行禁用后，禽肉中SEM超標(biāo)的樣品數(shù)量卻屢增不減，同時(shí)歐盟在植物源性的罐裝食品中也發(fā)現(xiàn)SEM，SEM的來(lái)源引起了廣泛關(guān)注[2-3]。SEM在動(dòng)物源性面制品中的來(lái)源之一是呋喃西林藥物代謝物，作為穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物，化學(xué)性質(zhì)較原藥穩(wěn)定，因此往往被作為呋喃西林藥物的檢出依據(jù)；另一來(lái)源是面粉添加劑偶氮甲酰胺（Azodicarbonamide，ADC）的降解代謝物，ADC在高溫高濕環(huán)境下，會(huì)降解生成SEM，對(duì)于甲殼類水產(chǎn)面制品類如炸蝦，SEM還可能是內(nèi)源性物質(zhì)[4-6]。于慧娟等[7]研究發(fā)現(xiàn)SEM作為內(nèi)源性物質(zhì)普遍存在于蝦、蟹等甲殼類水產(chǎn)品中，經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)查閱大部分國(guó)內(nèi)對(duì)蝦內(nèi)源性SEM含量約在1 μg·kg-1[8]。由于ADC在降解過(guò)程中還有另一主要降解產(chǎn)物聯(lián)二脲（Biurea，BIU），且BIU不會(huì)由氨基脲轉(zhuǎn)化而來(lái)，因此SEM是否由ADC降解產(chǎn)生，可通過(guò)測(cè)定ADC的降解產(chǎn)物BIU進(jìn)行辨別。

本文通過(guò)制作添加ADC的炸雞和炸蝦，建立了液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定動(dòng)物源性面制品中BIU的方法[9-10]。同時(shí)參考標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 21311—2007中的前處理方式，在步驟中增加蛋白沉淀環(huán)節(jié)，建立了測(cè)定SEM的方法。探究了面粉及動(dòng)物源性面制品中ADC、BIU和SEM三者的含量關(guān)系，為食品中SEM的污染來(lái)源提供了判斷依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

面粉、雞腿肉、蝦肉，均購(gòu)自當(dāng)?shù)爻?；BIU（純度≥99.5%，美國(guó)Chem Service）；ADC（純度≥99%，美國(guó)Sigma公司）；13C2,15N2-BIU（純度≥99.5%，加拿大Toronto Research Chemicals公司）；SEM（純度≥99%）、13C,15N2-SEM（純度≥99%），德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；水為超純水，Millipore超純水儀制備；鄰硝基苯甲醛（純度≥98%，美國(guó)Sigma公司）；乙酸鋅（上海強(qiáng)順化工試劑有限公司）；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀和亞鐵氰化鉀（分析純，重慶川東化學(xué)試劑廠）；高錳酸鉀（重慶川東化工有限公司）；乙腈、正己烷、二甲亞砜和乙酸乙酯（色譜純，美國(guó)TEDIA公司）；甲酸（純度＞99%，美國(guó)ROE公司）；冰醋酸（色譜純，美國(guó)FLUKA公司）；對(duì)甲苯亞磺酸鈉（純度＞95%，美國(guó)Sigma公司）；乙酸銨（純度＞99%，美國(guó)Sigma公司）。

1.1.2 儀器

API 4000高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（AB sciex，美國(guó)）；強(qiáng)力振蕩器（北京安捷來(lái)科學(xué)儀器設(shè)備有限公司）；Sartorius BS224S型天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；XH-B型旋渦混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore，美國(guó)）；3-30K型離心機(jī)（Sigma，德國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 面糊的制備

準(zhǔn)確稱取30 g面粉，分別添加濃度水平為0 mg·kg-1、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1和45 mg·kg-1的ADC標(biāo)液，加入40 mL水?dāng)嚢杌靹蛘{(diào)成面糊。

1.2.2 炸雞腿的制備

新鮮雞腿洗凈，用刀在每個(gè)雞腿上都劃幾刀，在雞腿上均勻掛一層1.2.1中制作的面糊；炸鍋里的油溫加熱約達(dá)150 ℃（約五六成熱），將雞腿輕輕放入油鍋中，并用筷子不停地翻面，直到將雞腿炸成金黃色為止，撈出后瀝油。取雞腿的面粉層、雞肉內(nèi)層、雞肉外層分別制樣。

1.2.3 炸蝦球的制備

取鮮蝦去頭、尾和蝦殼，于粉碎機(jī)內(nèi)粉碎，稱取10 g蝦肉揉搓成球狀，為了使蝦肉成型，可以沾上薄薄的一層淀粉，將蝦球放入1.2.1制作的面糊中，裹上一層面糊；炸鍋里的油溫加熱約達(dá)150 ℃，將裹上面粉漿的蝦球輕輕放入油鍋中，并用筷子不停翻面，直到將蝦球炸至焦黃色熟透為止，撈出后瀝油。取蝦球的面粉外殼、蝦球內(nèi)層、蝦球外層分別制樣。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

準(zhǔn)確稱取適量BIU和13C2,15N2-BIU標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并配制成濃度為20 mg·L-1的BIU標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和濃度為10 mg·L-1的13C2,15N2-BIU內(nèi)標(biāo)工作液。室溫儲(chǔ)存，有效期1個(gè)月。根據(jù)需要取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ) 備液 用 水 稀 釋 成1 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1、100 μg·L-1、1 000 μg·L-1和20 000 μg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用現(xiàn)配。

準(zhǔn)確稱取適量SEM和13C,15N2-SEM標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并配制成濃度為100 mg·L-1的SEM標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和13C,15N2-SEM內(nèi)標(biāo)工作液，-18 ℃保存，有效期3個(gè)月。根據(jù)需要取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成0.5 μg·L-1、1.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、50.0 μg·L-1和100.0 μg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用現(xiàn)配。

1.2.5 BIU的測(cè)定

（1）樣品前處理。準(zhǔn)確稱取2.0 g（精確至0.001 g）樣品于50 mL離心管中，分別加入濃度為10 mg·L-113C2,15N2-BIU內(nèi)標(biāo)工作液0.2 mL和10 mL水，渦旋混勻，采用5 mL正己烷脫脂后，于振蕩器上振蕩 提 取15 min，8 000 r·min-1離 心5 min，吸 取 上層清液于25 mL比色管中，重復(fù)提取1次，合并提取液，分別加入2 mL 1.00 mol·L-1乙酸鋅溶液與0.25 mol·L-1亞鐵氰化鉀溶液，用水稀釋至刻度，提取液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，加入5 mL正己烷，8 000 r·min-1離心3 min，準(zhǔn)確吸取5 mL下層待測(cè)液于另一離心管中，加入200 μL 0.14 mol·L-1高錳酸鉀溶液，振蕩反應(yīng)30 min，加入50 μL二甲基亞砜，振蕩3 min后，加入2.5 mmol·L-1對(duì)甲苯亞磺酸鈉溶液5 mL，振蕩衍生反應(yīng)10 min，離心，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后供液相色譜質(zhì)譜分析。

（2）色譜測(cè)定條件。色譜柱：Shimpak XRODSⅡ（150 mm×2.0 mm，2.2 μm）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為2 mmol·L-1乙酸銨溶液（含0.2%甲酸）；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 液相色譜的梯度洗脫程序

（3）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI）；離子化模式：正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；離子源溫度（TEM）：650 ℃；毛細(xì)管電壓（IS）：5 500 V；氣簾氣壓力（CUR）：35 psi；霧化氣壓力（GS1）：80 psi；輔助氣壓力（GS2）：50 psi；監(jiān)測(cè)離子對(duì)、駐留時(shí)間、去簇電壓和碰撞電壓等參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 監(jiān)測(cè)離子對(duì)、駐留時(shí)間、去簇電壓和碰撞電壓等參數(shù)表

1.2.6 SEM的測(cè)定

（1）樣品前處理。稱取1 g樣品（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，分別加入濃度為20 μg·L-1的13C,15N2-SEM內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，用10 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液提取，加入200 μL 0.1 mol·L-1鄰硝基苯甲醛溶液（二甲亞砜配制）衍生，渦旋混勻，置于37 ℃恒溫箱中振蕩反應(yīng)16 h。取出樣品，待冷卻至室溫后加入1.0 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液5 mL，用1.0 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.5，依次加入2 mL 106 g·L-1亞鐵氰化鉀溶液和220 g·L-1乙酸鋅溶液沉淀劑，加入15 mL乙酸乙酯提取，離心，收集乙酸乙酯層于旋蒸瓶，重復(fù)提取1次，于40 ℃下水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入1 mL乙腈-水（2∶8，V/V）溶解殘?jiān)?，? mL乙腈飽和的正己烷脫脂，樣液過(guò)0.22 μm濾膜后供液相色譜質(zhì)譜分析。

（2）色譜測(cè)定條件。高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀：四極桿串聯(lián)質(zhì)譜；離子源類型：ESI；色譜 柱：Shimadzu VP-ODS C18（150 mm×2.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；梯度洗脫程序見(jiàn)表3。

表3 液相色譜的梯度洗脫程序

（3）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI）；離子化模式：正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；毛細(xì)管電壓：5 500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣（CUR）：45 psi；霧化氣（GS1）：20 psi；輔助氣（GS2）：60 psi；碰撞氣（CAD）：10 psi；監(jiān)測(cè)離子對(duì)、駐留時(shí)間、去簇電壓和碰撞氣能量等參數(shù)見(jiàn)表4。

表4 監(jiān)測(cè)離子對(duì)、駐留時(shí)間、去簇電壓和碰撞氣能量等參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍

以BIU的濃度與內(nèi)標(biāo)13C2,15N2-BIU的濃度比為橫坐標(biāo)，衍生產(chǎn)物對(duì)甲苯磺酰氨基脲的峰面積與13C15N-對(duì)甲苯磺酰氨基脲峰面積比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果表明，BIU在1～20 000 μg·L-1具有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=1.219 6x+0.030 9，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9。

以SEM濃度與內(nèi)標(biāo)13C,15N2-SEM的濃度比為橫坐標(biāo)，氨基脲衍生化產(chǎn)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，SEM在0.50～100.00 μg·L-1線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.029 3+0.145 5x，R2為0.999 4。

2.2 回收率和精密度

選取經(jīng)測(cè)定本底不含BIU和SEM的面粉外殼、炸雞肉和炸蝦肉3種樣品，分別添加BIU濃度為1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-13個(gè)水平的標(biāo)液和SEM濃度為0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-13個(gè)水平的標(biāo)液進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平進(jìn)行6個(gè)平行測(cè)定。結(jié)果表明，BIU的平均回收率為81.6%～109.3%，RSD為2.78%～11.67%。SEM的平均回收率為88.8%～99.4%，精密度為4.8%～11.5%，滿足分析需求。具體結(jié)果見(jiàn)表5、表6。

表5 不同面粉制品中BIU的平均回收率和精密度（n=6）

表6 不同面粉制品中SEM的平均回收率和精密度（n=6）

2.3 ADC在炸雞肉和炸蝦肉中形成BIU和SEM的影響因素

測(cè)定經(jīng)處理的炸雞肉與炸蝦肉中BIU與SEM的含量，結(jié)果如表7所示。當(dāng)面粉中不含ADC時(shí)，制作的炸蝦球與炸雞肉中面粉和肉中均未檢出BIU，面粉部分和雞肉中均未檢出SEM，但在蝦 肉 中 檢 出 少量 的SEM（含 量 為1.5 μg·kg-1）。當(dāng)面粉中ADC的添加量為10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、45 mg·kg-1時(shí)，炸雞腿與炸蝦球的面粉部分、肉表層與內(nèi)層均檢出了BIU與SEM，且含量遠(yuǎn)高于空白組中的含量，隨著ADC添加量的增大其檢出量也呈增加的趨勢(shì)。表明添加ADC的面粉經(jīng)處理后會(huì)產(chǎn)生BIU和SEM擴(kuò)散至肉中。同時(shí)經(jīng)線性擬合發(fā)現(xiàn)，面粉部分、雞肉內(nèi)外層、蝦肉內(nèi)外層的BIU含量與ADC的含量呈較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.972 1～0.998 6。

表7 含ADC面粉處理的炸雞腿和炸蝦肉中BIU和SEM的含量

而在同一ADC添加濃度下，雞肉與蝦肉中BIU與SEM的含量由外到內(nèi)逐漸遞減。在炸蝦肉面粉層中BIU與SEM的含量分別是外層蝦肉的3.5～4.2倍與3.5～9.5倍，蝦肉外層BIU與SEM含量分別是內(nèi)層的1.5～2.2倍與1.1～3.5倍，炸雞肉中面粉層中BIU與SEM的含量分別是外層雞肉的5.6～7.9與4.2～11.1倍，外層雞肉BIU與SEM含量分別是內(nèi)層雞肉的3.1～4.8倍與3.7～13.4倍；說(shuō)明添加ADC的面粉處理肉制品后，降解生成的BIU與SEM會(huì)向雞肉與蝦肉里層擴(kuò)散，到達(dá)越里層的肉中BIU與SEM越少。

MULDER等[11]研究了新鮮的海鮮與禽類、面粉處理后的海鮮與禽類中的BIU與SEM的含量，發(fā)現(xiàn)ADC面粉處理后的肉類中SEM的含量遠(yuǎn)高于新鮮的肉類，這與本研究的結(jié)論一致。如果面粉處理的肉制品中測(cè)定出不含有BIU，那么SEM可能來(lái)源于呋喃西林的代謝殘留；如果檢測(cè)出BIU，那么SEM還可能來(lái)源于ADC的降解。因此，可將BIU作為區(qū)分動(dòng)物源性食品中SEM來(lái)源的一種指示性化合物。同時(shí)，MULDER等[11]研究發(fā)現(xiàn)，ADC處理后的肉制品中如果含有1 μg·kg-1的SEM，則至少含有50 μg·kg-1的BIU；而本研究發(fā)現(xiàn)ADC處理后的肉制品中如果含有1 μg·kg-1SEM，則至少含有89 μg·kg-1的BIU，造成這一差異的原因可能是肉制品的加工制作工藝不同。

綜上所述，炸雞肉與炸蝦肉中若其面粉中添加ADC，相應(yīng)樣品中會(huì)檢出SEM，使呋喃西林藥物的檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，而測(cè)定ADC的特征性降解產(chǎn)物BIU的含量可以鑒別食品中SEM的來(lái)源。同時(shí)，可通過(guò)降低面粉中ADC的添加量以達(dá)到減少SEM的目的，從而確保面制品食品安全。

3 結(jié)論

本文通過(guò)制作添加不同水平ADC面粉的炸蝦肉和炸雞肉，利用經(jīng)驗(yàn)證的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分別測(cè)定其面粉層、肉表層、肉里層的BIU和SEM含量，并探究炸蝦肉和炸雞肉的不同部位中ADC的添加量與BIU和SEM生成量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)含有ADC的面粉處理后的肉類中SEM的含量一方面來(lái)源于呋喃西林藥物代謝，另一方面來(lái)源于面粉中偶氮甲酰胺的降解產(chǎn)物，部分蝦肉中還有可能是內(nèi)源性物質(zhì)，因?yàn)锳DC降解產(chǎn)物中包含BIU，而B(niǎo)IU不會(huì)由SEM轉(zhuǎn)化而來(lái)，所以可將BIU作為動(dòng)物源性面制品中SEM來(lái)源于ADC的一種指示性化合物。