高效液相色譜法測定番茄醬中11種工業染料

鞠光秀，呂曉靜，劉 暢，楊 超，曲 欣*

（1.青島市疾病預防控制中心/青島市預防醫學研究院，山東青島 266033；2.山東省質量技術審查評價中心有限公司，山東濟南 250014）

合成著色劑也稱為合成色素，是食品加工中重要的一類食品添加劑，《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）[1]規定，食品中允許使用的合成著色劑只有日落黃等11種，除此以外，都禁止添加到食品中[2]。工業染料著色力強且價格低廉，常有不法商販將其非法添加到食品中以謀取不正當利益。工業染料長期使用會產生致敏、致畸或致癌作用[3]。

目前，檢測食品中禁用工業染料的方法主要有超高效液相色譜-串聯質譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLCMS/MS）[4-5]和高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[6-7]。UPLC-MS/MS

靈敏度高、分辨率好，但儀器價格昂貴；HPLC使用普遍，具有成本低、靈敏度高等優點。番茄醬的工業染料污染備受關注。本研究以違法添加較多的11種工業染料為檢測對象，通過前處理方法及液相色譜條件的優化，建立了同時檢測番茄醬中11種工業染料（紅2G、酸性橙Ⅱ、堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、羅丹明B、對位紅和蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ）的高效液相色譜方法。

1 材料與方法

1.1 設備與試劑

設備：1260Ⅱ高效液相色譜儀，配DAD檢測器（安捷倫公司）；N-EVAP 112氮吹儀（Organomation公司）；Heraeus Megafuge 8R高速冷凍離心機（Thermo Fisher公司）；KQ5200DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器）。

試劑：酸性橙Ⅱ為AccuStandard產品；紅2G、羅丹明B、對位紅均為Dr. Ehrenstorfer GmbH產品；蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ均為First Standard產品；堿性橙2、堿性橙21和堿性橙22均為CNW產品。甲醇、乙腈、乙酸銨、乙酸均為色譜純；氨水為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

用乙腈溶解并配制濃度為10 μg·mL-1的11種工業染料混合標準溶液。移取適量上述混合標準溶液，用乙腈-水（1∶1，V/V）溶液稀釋成濃度為0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1、6.0 μg·mL-1和10 μg·mL-1系列標準溶液。

1.2.2 色譜條件

ZORBAX SB-C18色 譜 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣體積：10 μL；流動相：A 0.02 mol·L-1乙酸銨-0.1%乙酸水溶液，B 乙腈；檢測波長：450 nm、485 nm和520 nm；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.2.3 樣品前處理

稱取均勻的番茄醬樣品5 g于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈（含0.5%乙酸），渦旋混勻1 min、超聲提取10 min，5 000 r·min-1離心5 min獲取上清液并置于另一離心管中，再次加入10 mL乙腈-水（1∶1，V/V）溶液重復提取一次，合并兩次提取液，移取5 mL提取液40 ℃水浴下氮吹至近干，使用乙腈-水（1∶1，V/V）溶液定容至2 mL，過0.22 μm濾膜上機。

1.2.4 試驗優化

（1）色譜條件中檢測波長的優化。采用DAD檢測器，分別采集每種化合物的最大吸收波長，綜合采集到的波長數據，對最大吸收波長相近的化合物采用同一波長進行檢測。

（2）前處理方法中提取溶劑的選擇優化。提取溶劑的選擇對實驗的成敗至關重要，實驗中綜合分析各個化合物的理化性質，兼顧提取效率和實驗成本，選取對目標化合物溶解性較好的溶劑，并考察了不同組合溶劑的提取效果。

2 結果與分析

2.1 色譜條件中檢測波長的優化

11種化合物都有較強的紫外-可見光吸收，最大吸收波長在410～550 nm。兼顧靈敏度的前提下，最大吸收波長相近的化合物選擇了同一波長。450 nm波長下檢測堿性橙2，485 nm波長下檢測酸性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22、對位紅和蘇丹紅I～Ⅱ，520 nm波長下檢測紅2G、羅丹明B、蘇丹紅Ⅲ～Ⅳ。標準色譜圖如圖1所示。

圖1 11種工業染料混合標準溶液色譜圖

2.2 前處理方法中提取溶劑的選擇優化

2.2.1 提取溶劑

工業染料常用的提取溶劑有水、甲醇、乙腈、丙酮和混合溶液等。11種化合物中，紅2G水溶性強，酸性橙Ⅱ、羅丹明B、堿性橙2、堿性橙21和堿性橙22在水和有機溶劑中都有一定的溶解性，對位紅和蘇丹紅染料都不溶于水而易溶于有機溶劑。實驗中考察了多種溶劑分別在提取溶劑用量為10 mL、20 mL、30 mL條件下的提取效率。提取溶劑用量為20 mL時，不同提取溶劑各化合物的回收率見表2（超聲時間為20 min）。結果表明，乙腈（含0.5%乙酸）比甲醇、純乙腈具有更高的提取效率，除紅2G和酸性橙Ⅱ外，其他染料的回收率達到75%以上。選用乙腈-水（1∶1，V/V）進行二次提取，紅2G和酸性橙Ⅱ的回收率明顯提高。故選擇10 mL乙腈（含0.5%乙酸）和10 mL乙腈-水（1∶1，V/V）各提取一次，經過兩次提取，回收率在85%以上。

表2 4種提取溶劑加標回收率（單位：%）

2.2.2 溶劑用量

固定提取溶劑為乙腈（含0.5%乙酸）和乙腈-水，考察了不同溶劑用量（5 mL+5 mL、7.5 mL+7.5 mL、10 mL+10 mL、12.5 mL+12.5 mL、15 mL+15 mL、20 mL+20 mL）對11種染料回收率的影響。用量為5 mL+5 mL時，部分化合物的回收率小于50%，表明此用量不能將相應化合物完全提取出來；用量為7.5 mL+7.5 mL時，所有染料回收率明顯提高，達到80%以上；用量為15 mL+15 mL和20 mL+20 mL時，個別染料的回收率稍有提高，但是增加溶劑用量對回收率貢獻較小。故選擇提取溶劑為10 mL乙腈（含0.5%乙酸）和10 mL乙腈-水，兩次提取。

2.2.3 超聲時長

實驗中考察了單次超聲時長（5 min、10 min、15 min、20 min）對11種染料回收率的影響。結果表明，除單次超聲5 min大部分染料的回收率小于80%外，其他超聲時長下，所有11種染料的回收率皆大于80%，但是延長超聲時長對回收率貢獻較小，故乙腈（含0.5%乙酸）和乙腈-水用量都為10 mL，每次超聲時長為10 min。

2.3 方法線性和檢出限

以目標化合物的峰面積對其質量濃度進行線性回歸，發現11種工業染料在1.2.2所述色譜條件下分離效果良好，線性范圍為0.5～10.0 μg·mL-1，相關系數在0.999以上。紅2G、酸性橙Ⅱ、堿性橙2、堿性橙21、羅丹明B、對位紅、堿性橙22和蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的線性方程分別為y=13.08x-0.060、y=5.672x+0.001、y=19.58x+0.123、y=29.84x-0.328、y=42.61x-5.402、y=21.99x+0.345、y=22.23x-1.342、y=42.28x-0.683、y=45.45x-3.065、y=40.78x+3.174、y=20.65x+1.331，通過配制一系列低濃度的標準溶液，依據3倍信噪比計算其檢出限，檢出限分別為0.25 mg·kg-1、0.35 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.15 mg·kg-1、0.08 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.08 mg·kg-1、0.08 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1和0.20 mg·kg-1。信 噪 比為10時的濃度為定量限。

2.4 加標回收率和精密度

取番茄醬的空白樣品進行高、中、低（分別為8.0 mg·kg-1、3.2 mg·kg-1、1.6 mg·kg-1）3個 濃 度 水平的加標實驗，且每個濃度進行6次平行測定，計算平均回收率和精密度，發現本方法的回收率在80.6%～97.6%，相對標準偏差為1.76%～5.89%，準確性與重現性均符合要求。結果如表3所示。

表3 加標回收率和相對標準偏差（n=6）

（續表3）

2.5 實際樣品測定

在青島市區內超市、農貿市場上采購不同品牌的番茄醬50份，應用本法進行測定，所測樣品均未檢出11種工業染料。

3 結論

本研究建立了同時測定番茄醬中11種工業染料的高效液相色譜方法。該方法前處理簡單、回收率高、精密度好、分析成本低，可應用于普通實驗室中對番茄醬中11種工業染料的日常分析檢測。