D-101大孔吸附樹脂純化沙棘葉黃酮的特性研究

黃 莎，劉燕梅，昌 琴，楊 聆，蘇紫艷，楊 娟

（宜賓市產品質量監督檢驗所，四川宜賓 644002）

沙棘屬胡頹子科的一種果實，多年生落葉灌木或者小喬木[1]，具有抵御干旱、抵抗寒冷的特性，且生態適應能力較強[2-3]。因富含大量維生素，被稱為“天然維生素寶庫”。沙棘富含多種生理活性物質和營養成分，黃酮類化合物為主要生物活性物質，具有清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒和調節免疫等功能[4-7]。大孔吸附樹脂具有多孔網狀結構和良好的吸附性能，可用于提取分離水溶性成分[8]。湯如瑩[9]等用D101型大孔吸附樹脂探究分離純化沙苑子總黃酮的工藝。本項目通過探究大孔吸附樹脂的特性并得出沙棘黃酮純化的最優工藝，為后續工業化生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

蘆丁標準品（≥95%）（成都瑞芬思生物科技有限公司）；95%乙醇、亞硝酸鹽、硝酸鋁、硝酸鈉、氫氧化鈉（成都領江化工廠）；D-101大孔吸附樹脂（西安藍曉科技有限公司）；沙棘葉。

1.2 儀器與設備

超聲波粉碎機（廣東市旭明有限責任公司）；電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；旋轉蒸發儀（上海亞榮市生化儀器廠）；真空抽濾機（鞏義市予華儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（上海瑯玕實驗有限責任公司）；紫外可見分光光度計（上海分析儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 實驗步驟

沙棘黃酮浸膏的制備→D-101大孔樹脂預處理及裝柱→原液混勻裝柱→對照品的配制。

1.3.2 沙棘葉黃酮的測定方法

采用外標法，稱量蘆丁3 mL于25 mL的比色管中，加60%的乙醇定容到3 mL，依次加入5%亞硝酸鈉，10%硝酸鋁，各1 mL，分別搖勻靜置6 min，再加入10%氫氧化鈉，用30%乙醇定容到25 mL，搖勻靜置15 min在500 nm波長處測定吸光度（除空白不加氫氧化鈉外，其他都要加）。

1.3.3 靜態吸附

將活化后的大孔吸附樹脂2 g（濕重）加30 mL的樣液，振蕩2 h并放置24 h，過濾并測定吸光度，計算靜態吸附量、吸附率。向吸附后的樹脂中加入95%的乙醇80 mL，振蕩2 h并靜置24 h，測定解吸液的吸光度。計算靜態解吸量、解吸率。

1.3.4 泄漏曲線

稱取12.5 g 20 mL活化后的D-101大孔樹脂裝柱，以沙棘浸膏質量0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1的上樣濃度，速度1 BV·h-1（BV為20 mL），采樣80 mL，且每0.5 BV收集1管，收集8管，測定質量濃度，繪制泄漏曲線。

1.3.5 動態吸附行為考察

稱取12.5 g 20 mL活化后的D-101大孔樹脂裝柱，以1 BV·h-1的速度進樣20 mL 0.04 g·mL-1浸膏，再以4 BV蒸餾水，1 BV·h-1的流速沖洗填柱，每隔0.5 BV收集沖洗液（同時記錄消耗時間），測定其中的黃酮含量（同時測量沖洗液體積并記錄）。以柱體積（BV）為橫坐標，黃酮含量為縱坐標繪制動態吸附曲線。

1.3.6 洗脫劑與洗脫體積的選擇

采 用 不 同 濃 度 的 乙 醇（10%、30%、50%、70%、）各100 mL（5 BV），流速為1 BV·h-1沖洗，填柱，且每隔0.5 BV收集沖洗液（同時記錄消耗時間），測定其中的黃酮含量（同時測量沖洗液體積并記錄）。

1.3.7 計算公式

（1）純化物總黃酮含量的計算。公式為

式中：m1—純化物總黃酮含量，g/100 g；m—由外標算得被測液中黃酮量，mg；V1—測定用試樣體積，mL；V2—試樣定容總體積，mL。

（2）吸附量、吸附率、解吸量和解吸率的計算。公式依次為

式中：ρ1—上樣液中總黃酮的質量濃度，mg·g-1；ρ2—水洗液中總黃酮的質量濃度，mg·g-1；ρ3—醇洗液中總黃酮的質量濃度，mg·g-1；V1—上樣液的體積，mL；V2—水洗液的體積，mL；V3—醇洗液的體積，mL；M—樹脂的質量，g。

2 結果與分析

2.1 靜態吸附黃酮結果

上樣浸膏黃酮的含量為（4.23±0.07）mg·mL-1，其結果如下（見表1）。

表1 靜態吸附黃酮吸附量、吸附率、解吸量、解吸率

2.2 動態吸附泄漏曲線

由圖1～圖3可得，不同濃度的浸膏含量對泄漏曲線的影響較大；隨濃度增大，泄漏點體積呈逐漸減小且趨于平穩趨勢。浸膏濃度0.01 g·mL-1時，在0.5～3.5 BV時，所測得的黃酮含量增幅較小，在4 BV時，黃酮含量峰面積明顯增大，黃酮此時發生泄漏，4 BV為其泄漏點。浸膏含量為0.02 g·mL-1時，在0.5～1.0 BV時，所測得的黃酮值偏小且穩定。在1.5 BV時，黃酮含量峰面積明顯增大，黃酮此時發生泄漏。浸膏含量為0.04 g·mL-1，在0.5～1.0 BV時，黃酮含量呈增大趨勢，但隨樣液體積增大，在1.5 BV時，峰面積明顯增大，1.5 BV為其泄漏點。此后，隨樣液體積增大，黃酮含量緩慢增加。以相同流速上樣時泄漏點越低，說明樹脂對黃酮的吸附能力越好，從效率角度出發，濃度越大黃酮的吸附效果更好，故選取0.04 g·mL-1浸膏為上樣的最佳濃度。

圖1 0.01 g·mL-1浸膏泄漏曲線

圖2 0.02 g·mL-1浸膏泄漏曲線

圖3 0.04 g·mL-1浸膏泄漏曲線圖

2.3 水洗除雜動態洗脫曲線

取0.04 g·mL-1的浸膏濃度，黃酮的濃度為（5.60±0.07）mg·mL-1，取樣體積為0.1 mL。由圖4可知，黃酮吸附量隨著水洗液體積的變化呈先降低后升高并趨于穩定，其中水洗體積在1 BV時黃酮和大量的雜質被水洗液水洗出，吸附量最低；當水洗體積達到3 BV后，水洗液中黃酮含量不再增大，此時大孔吸附樹脂所吸附的黃酮含量趨于穩定，故選取3 BV為最佳水洗體積。

圖4 0.04 mg·mL-1浸膏動態洗脫曲線

2.4 洗脫劑濃度的選擇和醇洗脫體積選擇

由圖5可知，隨著濃度的增大，解吸的峰值呈先增大后減小趨勢，根據所測黃酮峰值大小，綜合考慮成本，可選擇50%和70%醇洗脫劑，不同濃度的乙醇溶液在醇洗液體積為3 BV時所測含量趨于穩定，大孔吸附樹脂中的黃酮絕大多數被洗脫出來，因此3 BV為最佳的解吸體積。

圖5 不同乙醇濃度對黃酮吸附的影響

2.5 醇洗脫濃度和體積的確定

由圖6可知，隨著濃度的增加，被解吸的黃酮總量呈先增加后下降趨勢，濃度為50%時為最高值。洗脫液3 BV與5 BV條件下，黃酮解吸含量差異較小，為考慮工藝成本可選擇3 BV的洗脫體積。

圖6 不同濃度乙醇洗脫液中的黃酮總量比較

2.6 動態吸附黃酮驗證實驗

采 用0.04 g·mL-1浸 膏， 黃 酮 含 量 在（5.67±0.27）mg·mL-1，上樣體積1 BV，水洗體積3 BV、水洗速度1 BV·h-1，醇洗濃度50%、體積3 BV，速度1 BV·h-1。其結果如表2所示。

表2 動態吸附黃酮吸附量、吸附率、解吸量、解吸率

3 結論

大孔吸附樹脂可分為靜態吸附和動態吸附兩種方式，其型號根據其孔徑顆粒的大小及其吸附的范德華力的不同，分為不同的種類和型號，在國內有9AB-8、ADs-8[10-11]等類型。本項目通過研究D-101大孔吸附樹脂對沙棘黃酮的吸附情況，得出了動態吸附方式優于靜態吸附。當上樣濃度為0.04 mg·mL-1浸膏、上樣體積1 BV、水洗體積3 BV、醇濃度50%、醇洗體積3 BV、上樣流速1 BV·h-1、洗脫流速1 BV·h-1，此工藝下動態吸附量為8.04 mg·g-1，吸附率為87.04%，解吸量為8.18 mg·g-1，解吸率為92.00%。因此，后續相關研究中可采用不同型號大孔樹脂對黃酮的吸附情況進行研究，以期得到更好的工藝條件，并運用于工業化生產中。