行為學訓練對大鼠內源性神經干細胞增殖分化及Wnt5a蛋白表達的影響

呂威力 邢雪松

(沈陽醫學院 1病理學教研室，遼寧 沈陽 110034；2解剖學教研室)

研究發現成年動物腦內神經干細胞(NSCs) 的增殖分化促進腦缺血修復，通過分化的新生神經元替代受損的神經元，在一定程度上能夠改善神經功能缺損〔1～4〕。 Wnt5a信號通路在促進細胞增殖分化等過程中起著十分關鍵的作用,參與調控細胞內多種信號途徑〔5〕。本研究建立大鼠血管性癡呆(VD)模型探討VD相關信號分子Wnt5a與內源性NSCs的改變及行為學訓練的影響，初步闡明VD中內源性VD增殖分化的機制。

1 材料和方法

1.1VD模型的制備 選用健康雄性2月齡wistar大鼠54只，體重220～240 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物許可證號〔SCXK(遼)2015-0001〕。隨機分為：假手術組(Sham組，3、7、14、21 d，n=6)，模型組(Model組，3、7、14、21 d,n=24)，訓練組(Training組，3、7、14、21 d,n=24)。采用兩血管阻斷加硝普鈉降壓法建立VD動物模型。術前4 h禁水，12 h禁食。手術臺上仰臥位固定大鼠，1%(45 mg/kg)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，常規消毒后進行頸正中切口，分離兩側頸總動脈(CCA)，雙側迷走神經用玻璃針分離，注意避免牽拉，在夾閉雙側頸總動脈之前，腹腔注射2.5 mg/kg硝普鈉，然后動脈夾無創夾閉雙側頸總動脈10 min，再通10 min，再10 min夾閉，打開動脈夾縫合傷口，局部慶大霉素抗菌后放回籠中正常飼養。用多導生物記錄儀在實驗過程中統計大鼠血壓，結果顯示大鼠平均動脈壓在103 mmHg左右，注射硝普鈉后動脈壓迅速下降到51 mmHg左右，2 min后動脈壓會緩慢上升到69 mmHg，持續1 h左右。大鼠在實驗過程中直腸溫度保持在37℃左右，以防止溫度降低對腦缺血損傷的修復作用。假手術組不注射硝普鈉和阻斷頸總動脈，其他處置與建模大鼠相同。造模1 d后訓練組給予行為學訓練，分別在3、7、14、21 d后處死取腦，然后進行蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.2穿梭箱訓練 條件刺激是聲音，非條件刺激是電擊。將大鼠先放在穿梭箱內進行暗適應5 min，然后進行聲音刺激5秒，如果大鼠不穿梭到另一側，就進行電擊，電流強度為15 mA，使大鼠逃到另一側不通電的箱底，然后電擊停止。如果不逃到另一側箱底就電擊5 s。讓大鼠休息30 s后進行下一輪訓練。穿梭箱訓練在造模后進行，每次進行20次聲和電的刺激實驗。

1.3行學評分 各組大鼠手術后進行模型篩選，大鼠造模是否成功主要通過神經行為學評分進行評定，神經行為學評分參照了Zea Longa等〔16〕5分制標準：沒有神經功能缺損0分；前爪不能完全伸展1分；大鼠行走的時候向兩側晃動2分；大鼠行走時身體向兩側傾倒3分；不能自發行走意識喪失4分。評分后0分和4分大鼠要被剔除，補充確保每個亞組6只大鼠。

1.4Nestin免疫熒光染色 常規灌注各組大鼠，然后取腦，連續冠狀冰凍切片，片厚約30 μm，進行免疫熒光檢測。PBST 0.01 mol/L洗滌切片，30 min 37℃孵育。硼酸緩沖液0.1 mol/L浸泡，PBST 0.01 mol/L洗滌。加入血清A，15 min 37℃孵育，勿洗傾去。滴加稀釋1∶2 000的羊抗Nestin一抗，4℃過夜。PBST 0.01 mol/L洗滌。滴加1∶100四甲基若丹明異硫氰酸鹽(TRITC)-兔抗山羊二抗，避光30 min 37℃孵育。0.01 mol/L PBST洗滌，貼片避光陰干稀釋甘油封片后進行熒光顯微鏡觀察和拍片。選取每只大鼠切片中3張具有典型反應的切片，在海馬齒狀回區每張切片取3個視野進行計數，采用Image-Pro Plus5.0圖像處理軟件對結果進行圖像分析處理進行Nestin陽性細胞計數。

1.5Wnt5a 的免疫組織化學檢測 取各組缺血大鼠前囟-3.14～前囟-4.5 mm海馬區，片厚3 mm左右，4%多聚甲醛固定液浸入24 h后，應用免疫組織化學染色檢測Wnt5a在缺血海馬的表達情況。37℃在切片上滴山羊血清30 min，分別4℃過夜滴加一抗兔抗鼠Wnt5a，37℃滴二抗60 min，37℃滴入ABC復合液60 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后二氨基聯苯胺(DAB)顯色15 min，蒸餾水沖洗后常規脫水，透明中性樹膠封片。陰性對照片用0.01 mol/L PBS代替一抗。光鏡下用Metamorph/Evolution MP5.0顯微圖像分析系統每張切片測5個相同單位面積的平均灰度值。

1.6統計學方法 采用SPSS10.0軟件進行t檢驗和方差分析。

2 結 果

2.1行為學評分 Sham組大鼠神經功能評分均為(0.00±0.00)分，無缺損。Training組與Model組相比，行為學評分下降明顯〔(2.21±0.31)分vs(3.01±0.27)分，P<0.05〕。

2.2穿梭箱測試結果 與Sham組相比，Model組AAR和PAR率都顯著下降(P<0.05)。Training組的AAR和PAR率顯著高于Model組(P<0.05)。見表1。

表1 各組穿梭箱測試結果比較

2.3HE染色評估組織學改變 Sham組海馬神經元排列整齊，結構清晰，神經元數量密集；Model組細胞周圍的間隙變寬，神經元腫脹變性，分布不均，3 d亞組變化明顯；見圖1。與Model組比較，Training組海馬神經元腫脹明顯減少，細胞形態明顯改善，神經元數量較多。

圖1 Model組和 Training組3 d HE染色(×400)

2.4Nestin免疫熒光染色檢測 Sham組海馬可見切片上少量的散在的Nestin陽性細胞,3 d、7 d、14 d、21 d間比較無統計學意義(P>0.05)。Model組3 d組,缺血海馬Nestin免疫陽性細胞表達開始增多,表現為大小不一并且呈簇狀分布;7 d組Nestin陽性細胞達峰值;21 d組缺血海馬Nestin免疫陽性細胞數有所減少，但是持續表達;Training組與Model組比較,3 d、7 d、14 d和21 d缺血海馬Nestin免疫陽性細胞都顯著增多(P<0.05) 。見表2、圖2。

圖2 各組海馬Nestin及Wnt5a陽性細胞(×400)

表2 各組Nestin陽性細胞數表達及Wnt5a表達比較

2.5Wnt5a免疫組織化學檢測 腦組織切片中顯示Wnt5a蛋白陽性細胞為細胞質內有黃色或棕褐色顆粒。Sham組Wnt5a在海馬表達輕微。Model組7 d Wnt5a反應陽性產物比Sham組明顯增多，隨缺血再灌注時間的進一步延長逐漸減少，14 d組表達逐漸減少，直到21 d組(P<0.05)。Training組在缺血海馬神經元胞質內可見棕黃色顆粒Wnt5a表達，較Model組各亞組陽性產物表達增加(P<0.05)。見表2。

3 討 論

VD是由腦血管因素造成腦組織損害所引起的癡呆綜合征，主要臨床癥狀為記憶力減退、表情淡漠和人格改變。目前已經證實在成人海馬齒狀回的顆粒下區有一定數量內源性NSCs。在一定條件下缺血NSCs反應性增殖，遷移到受損部位并且分化為神經元和神經膠質細胞，最終對神經功能修復的過程具有一定的促進作用〔7～9〕。

VD 患者缺血腦組織發生的病理性變化明顯，比如大量神經元凋亡，這些改變在缺血海馬組織中同樣可以觀察到，并且可以逐漸延伸到海馬周邊結構。目前研究海馬組織是VD患者缺血腦組織結構中最明顯的易受損區。海馬作為機體感覺和運動的整合區，同認知功能與中樞神經系統突觸的可塑性相關，是學習記憶的神經生物學基礎。同時海馬投射部位和學習記憶中樞有著不小的重疊區域，這樣就可以理解VD 和海馬之間的緊密聯系了〔10,11〕。

Wnts家族是富含半胱氨酸的分泌蛋白，可通過結合受體激活體內多種細胞內信號通路來調控多種生物功能，比如各種細胞的增殖分化、凋亡存活和遷移能力等。Wnt5a在胚胎期及出生后各種組織器官細胞功能的發育中發揮重要作用。Wnt5a可以促進胚胎發育過程中神經的生長，因此基因突變后可導致胚胎體軸發育不良導致死亡。Wnt5a信號途徑對脊椎動物早期發育同樣發揮著重要的作用，比如背腹排列方向，匯聚延伸及各器官的形成。異種移植模型表明，Wnt5a信號通路還可以通過激活促癌基因的異常表達包括基質金屬蛋白酶和層黏連蛋白，能使祖細胞增殖活性增強，參與腫瘤細胞的侵襲和轉移過程。現在證實Wnt5a確實可影響造血細胞的增殖分化，外周血單核細胞有Wnt5a及其受體Fz的表達可以促進其向樹突細胞的轉化。Wnt5a可以通過激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)，損害胰島素受體底物的活性，從而抑制胰島素信號，致使產生胰島素抵抗。越來越多的證據表明，Wnt5a不僅在胚胎發育、細胞分化、組織形成過程中起重要作用，Wnt5a及其信號轉導通路有可能成為疾病診斷與治療的分子靶點〔12～16〕。

本研究結果說明，穿梭箱訓練促進缺血海馬損傷修復中起到至關重要的作用，Wnt5a對神經干細胞增殖分化具有促進作用。